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在神经系统疾病研究中，蛋白瓜氨酸化修饰（citrullination）与多种疾病相关，其中 Pad2 在中枢神经系统（CNS）作用不明。研究人员构建 Pad2 基因敲除（KO）小鼠模型，发现其出现焦虑样行为和记忆缺陷，还伴有突触相关蛋白及树突棘改变。该研究为探究 CNS 功能提供重要依据。
在生命科学和健康医学领域，蛋白质的翻译后修饰一直是研究的热点。其中，瓜氨酸化修饰（citrullination）作为一种独特的蛋白质翻译后修饰方式，逐渐受到科研人员的关注。瓜氨酸化是指在肽基精氨酸脱亚氨酶（PADs）的催化下，肽基精氨酸残基转化为肽基瓜氨酸的过程。在人体中，已鉴定出 5 种依赖钙的 PADs，分别为 PAD1 - 4 和 PAD6，而 PAD2 是中枢神经系统（CNS）中主要表达的 PAD 酶，主要定位于少突胶质细胞，负责髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化修饰。
此前研究发现，PAD2 催化的瓜氨酸化蛋白与多种神经系统疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）、朊病毒病（prion disease）和多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）等密切相关。然而，PAD2 在中枢神经系统中的具体生理功能仍不清楚，其缺失会导致动物行为和蛋白质水平发生何种变化也有待研究。为了深入探究这些问题，来自国内某研究机构的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Brain Research Bulletin》上。
该研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过 CRISPR/Cas9 技术构建了 Pad2 基因敲除（KO）小鼠模型，为后续研究提供了重要工具。其次，采用行为学测试，如旷场实验（Open Field Test）、高架十字迷宫实验（Elevated Plus Maze Test）、埋珠实验（Marble Burying Test）、悬尾实验（Tail Suspension Test）、强迫游泳实验（Forced Swimming Test）、Morris 水迷宫实验（Morris Water Maze）和新物体识别实验（Novel Object Recognition Test）等，评估小鼠的行为变化。此外，利用蛋白质免疫印迹（Western Blot）、免疫组化（Immunohistochemistry）和蛋白质组学（Proteomics）等技术，分析小鼠大脑中蛋白质水平的变化。
研究结果如下：
- Pad2 基因敲除小鼠的构建：通过 CRISPR/Cas9 敲除 Pad2 基因外显子 3 的启动子，成功获得了 Pad2 基因敲除小鼠。经鉴定，Pad2-/-小鼠海马体、大脑皮层和小脑中 PAD2 蛋白表达下调，且海马体 CA1 和 CA3 区域细胞数量与野生型（WT）小鼠无差异。
- Pad2 基因敲除小鼠在旷场实验中的异常表现：在旷场实验中，Pad2 基因敲除小鼠平均移动速度、总移动距离均低于野生型小鼠，且在中心区域的穿越次数、停留时间减少，在边缘区域停留时间增加，表明其运动功能异常且焦虑水平升高。
- Pad2 基因敲除小鼠焦虑样行为增加：高架十字迷宫实验中，Pad2 基因敲除小鼠在开放臂的移动距离和停留时间减少，在封闭臂停留时间增加；埋珠实验中，Pad2 基因敲除小鼠埋珠数量显著增多；而在悬尾实验和强迫游泳实验中，Pad2 基因敲除小鼠与野生型小鼠的不动时间无明显差异，综合表明 Pad2 基因敲除小鼠焦虑水平增加，但抑郁样行为无显著变化。
- Pad2 基因敲除影响小鼠海马体依赖的学习和记忆能力：Morris 水迷宫实验显示，Pad2 基因敲除小鼠在寻找平台时游泳距离更长、潜伏期更长，在目标象限的游泳距离百分比、穿越平台次数和停留时间均减少；新物体识别实验中，Pad2 基因敲除小鼠的物体识别指数降低，说明其空间学习和记忆能力受损。
- Pad2 基因敲除小鼠突触成分和树突棘密度的改变：蛋白质免疫印迹结果表明，Pad2 基因敲除小鼠海马体中一些突触和神经相关蛋白水平发生变化，如离子型谷氨酸受体 GluNR1 和 GluN2B 表达增加，代谢型谷氨酸受体 Grik5、Drebrin 和脑源性神经营养因子（BDNF）表达下调。免疫荧光染色显示，Pad2 基因敲除小鼠海马体中负责谷氨酸储存和释放的 vGluT3 的点状密度降低，海马体 CA3 区域髓鞘碱性蛋白（MBP）减少，且 CA3 区域树突棘密度显著降低，同时海马体中瓜氨酸化蛋白也明显减少。
- Pad2 基因敲除小鼠的蛋白质组学改变：蛋白质组学分析发现，Pad2 基因敲除小鼠海马体中有 148 种蛋白质上调，64 种蛋白质下调。这些差异表达的蛋白质与神经功能相关，涉及多个 KEGG 通路和 GO 分析中的生物过程、细胞成分及分子功能。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次构建了 Pad2 基因敲除小鼠模型，并发现其出现焦虑样行为和记忆缺陷。这些行为变化可能与海马体中谷氨酸能突触异常、树突棘密度降低以及相关蛋白表达改变有关。此外，研究还发现敲除 Pad2 基因导致的结果与人类疾病中 PAD2 水平变化的趋势存在差异，提示 PAD2 水平的精细调节对维持正常认知功能至关重要。虽然该研究揭示了 Pad2 在中枢神经系统中的重要作用，但仍存在一定局限性，如未深入探究 PAD2 影响焦虑功能的具体脑区。总体而言，该研究为深入理解 PAD2 在中枢神经系统中的功能以及相关神经系统疾病的发病机制提供了重要线索，为后续研究奠定了基础。
