综述：蟾蜍灵作为一种新型表皮生长因子受体（EGFR）降解剂的鉴定与表征

这篇文章聚焦于食管癌（EC）中常见的食管鳞状细胞癌（ESCC）。研究发现蟾蜍灵（Bufalin）能直接与 EGFR 相互作用，诱导其经内体 - 溶酶体途径降解，抑制 EGFR 信号传导，且抗肿瘤活性优于 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），有望成为新型 EGFR 靶向药物。

　　

引言

食管癌（EC）在全球范围内，发病率位居第六，癌症相关死亡率排第十。在中国，其死亡率位列第六，发病率则为第五。食管鳞状细胞癌（ESCC）是中国食管癌的主要类型，占所有确诊食管癌病例的 90%。目前，ESCC 的治疗手段多样，包括内镜下切除术、手术、化疗、放疗和靶向治疗等。但内镜下切除术和手术仅适用于极早期 ESCC 患者，多数 ESCC 患者确诊时已处于晚期，只能接受放化疗或靶向治疗，这些治疗方式常出现耐药问题，导致治疗失败甚至癌症复发。即便采用靶向治疗联合化疗或放疗的策略，临床疗效依旧有限，ESCC 患者的五年生存率较低。

临床上，针对 ESCC 的有效靶向治疗药物仍处于短缺状态，因此科研人员不断探索其他可能的治疗策略。通过对 ESCC 肿瘤进行基因组测序和分析，发现 EGFR 是多种肿瘤的有效治疗靶点。在 ESCC 中，EGFR 突变率仅 1%，且几乎不包含表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的特异性突变位点，但 EGFR 扩增在肿瘤中的占比为 15 - 28%，36.6% - 97% 的肿瘤存在 EGFR 过表达情况。高表达的 EGFR 会激活下游蛋白磷酸化，进而启动信号通路，与 ESCC 的发生发展密切相关。现有的 EGFR 靶向治疗药物，如 EGFR 单克隆抗体和 EGFR-TKI，仅能提高局部缓解率，无法延长患者生存期，且它们都是通过抑制 EGFR 磷酸化来抑制其激活，EGFR-TKI 的应用还依赖于特定突变位点的存在。鉴于 EGFR 在 ESCC 中的表达特点，降低 EGFR 表达水平的有效方式或许是使其降解。虽然已有针对难靶向蛋白的降解方法，如溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）、蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）等，但这些方法受蛋白位置和招募蛋白的限制。而天然产物为药物研发提供了丰富的结构模板，是开发靶向蛋白降解疗法的新兴有力资源，所以研究人员将目光投向天然产物，期望从中发现新型 EGFR 降解剂。

天然产物在药物研发进程中意义非凡。越来越多的研究致力于揭示天然产物的特性，包括明确其作用的细胞靶点以及干扰的信号通路。例如，从腺花香茶菜中分离出的二萜类化合物腺花素，可通过作用于过氧化物还原酶 I 和 II 展现出抗肿瘤活性。揭示天然产物抗肿瘤活性的机制，能为药物研发和临床治疗开辟新思路。

蟾蜍灵（Bufalin）源自传统中药蟾酥，已被证实可通过诱导自噬、细胞凋亡以及使细胞周期停滞在 G₂/M 期，对多种肿瘤发挥抗肿瘤作用。当下，诸多研究聚焦于探寻蟾蜍灵的作用靶点，以阐释其抗肿瘤活性的机制。在本次研究中，研究人员运用药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）测定结合质谱分析，发现蟾蜍灵能直接与 EGFR 相互作用。通过结构药理学方法和酶抑制动力学测定表明，蟾蜍灵属于 ATP 竞争性抑制剂。进一步研究证实，蟾蜍灵可诱导 EGFR 发生内吞作用，并在溶酶体中进一步降解，在 ESCC 中展现出比 TKIs 更优异的抗肿瘤活性。研究数据显示，蟾蜍灵激活了溶酶体途径来降解 EGFR，这为克服耐药性提供了一种基于天然产物的极具前景的策略。

细胞培养和试剂

实验中所用的蟾蜍灵购自 Sigma（产品编号 B0261）。MG132（S2619）、环己酰亚胺（CHX，S7418）购自 SelleckChem 公司。巴弗洛霉素 A1（HY - 100558）、氯化铵（NH₄CL，HY - Y1269C）、厄洛替尼（HY - 50896）、吉非替尼（HY - 50895）、阿法替尼（HY - 10261）、奥希替尼（HY - 15772）、EAI045（HY - 100213）均购自 MedChemExpress 公司。人源食管鳞状细胞癌 YES2、KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450、KYSE510、COLO680N 细胞在 37°C、5% CO₂培养箱中培养。

蟾蜍灵抑制食管鳞状细胞癌的细胞活性

为评估蟾蜍灵对细胞活性的影响，研究人员在一系列 ESCC 细胞系中使用了蟾蜍灵。结果显示，蟾蜍灵对所有测试的细胞系生长均有显著抑制作用，其半数抑制浓度（IC₅₀）在 19nM 至 183nM 之间。蟾蜍灵还能抑制 ESCC 细胞的集落形成，将细胞周期阻滞在 G₂/M 期，并且抑制细胞的迁移和侵袭能力。这些数据充分表明，蟾蜍灵在 ESCC 细胞上展现出了极具潜力的抗肿瘤能力。

讨论

表皮生长因子受体（EGFR）作为癌症治疗的主要靶点之一，在多种实体瘤中，其表达常因过表达、扩增和突变而发生改变。然而，由于获得性耐药的出现，EGFR 靶向治疗药物的疗效受到很大限制，因此迫切需要开发新型的 EGFR 靶向治疗策略。近期研究发现了一些能够有效抑制 EGFR 的天然化合物，这表明天然产物有可能成为开发新型 EGFR 抑制剂的潜在来源。

结论

综上所述，研究证实蟾蜍灵是一种 ATP 竞争性抑制剂，能够通过降解 EGFR 有效抑制其活性。蟾蜍灵通过内吞作用和自噬与 EGFR 结合，并促进其在溶酶体中的降解，这一作用机制与现有 EGFR 靶向药物不同。从功能、靶点、作用机制到治疗效果等多方面的研究结果表明，蟾蜍灵是一种天然小分子 EGFR 降解剂，具有开发成为新型 EGFR 靶向药物的潜力。

数据可用性

本研究期间生成或分析的其他数据包含在已发表文章及其补充信息文件中。

利益声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报道研究工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（32471256、81988101、81830086 和 82172930）、中国国家重点研发计划（2022YFC3401002）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2019 - I2M - 5 - 081）、北京市新星计划（Z191100001119038）、北京市卫生健康委员会项目（PXM2018_026279_000005）、广东省基础与应用基础研究基金（2019B030302012）等项目的资助。