编辑推荐：
壳聚糖在生物医学应用广泛，但内毒素污染影响其安全性和免疫效果评估。研究人员开展壳聚糖纯化研究，开发四步纯化法。结果显示该法有效降低内毒素水平且不改变关键性质，凸显内毒素评估和去除的重要性。
在生物医学领域，壳聚糖凭借其良好的生物相容性、免疫调节能力等特性，广泛应用于组织工程、药物递送、伤口愈合以及疫苗佐剂等多个方面。然而，就像平静湖面下隐藏的暗礁，壳聚糖在应用中存在着一些容易被忽视却至关重要的问题。一方面，不同来源的壳聚糖在关键理化性质，如脱乙酰度（Degree of deacetylation，DDA）和摩尔质量（Molar Mass，MW）上存在差异，且相关表征和报告往往不够全面和准确，这使得科研人员难以准确把握其在生物体内的作用机制。另一方面，内毒素污染这一 “隐形杀手” 严重威胁着壳聚糖的安全性和有效性。内毒素是革兰氏阴性菌外膜的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）结构，它能通过 TLR - 4 信号通路引发免疫反应，释放如白细胞介素 - 1β（Interleukin - 1β，IL - 1β）、肿瘤坏死因子 - α（Tumor Necrosis Factor - α，TNF - α）和白细胞介素 - 6（Interleukin - 6，IL - 6）等促炎细胞因子。由于壳聚糖的阳离子特性，它容易与 LPS 形成复合物，导致现有研究中壳聚糖的免疫刺激效果可能受到内毒素污染的干扰，从而使研究结果出现偏差。因此，准确评估和有效去除壳聚糖中的内毒素，成为亟待解决的关键问题。
为了攻克这些难题，来自国外的研究人员展开了深入研究。他们旨在开发一种简单有效的壳聚糖纯化方法，在降低内毒素水平的同时，最大程度保留其关键理化性质，从而为生物医学应用提供更安全可靠的壳聚糖材料。研究成果发表在《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，利用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）光谱技术测定壳聚糖的 DDA，通过特定的谱峰积分计算 DDA 值；采用尺寸排阻色谱多角度光散射（Size Exclusion Chromatography Multi - Angle Light Scattering，SEC - MALS）测定壳聚糖的摩尔质量分布和多分散指数（Polydispersity Index，PDI）。其次，运用显色鲎变形细胞溶解物（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）测定法对内毒素含量进行精准量化。此外，通过细胞培养和刺激实验，以 J774A.1 小鼠巨噬细胞为模型，评估壳聚糖纯化前后的免疫刺激特性，利用 Luminex? 200 系统检测细胞培养上清液中 IL - 1β、TNF - α 和 IL - 6 等细胞因子的水平。
研究结果如下：
- 商业壳聚糖表征差异与内毒素污染情况：对不同供应商的壳聚糖进行分析发现，其 DDA 和 MW 的实际测量值与供应商提供的规格存在差异，且所有供应商均未提供内毒素定量数据。LAL 检测显示，商业壳聚糖内毒素污染程度不一，MP Biomedicals 的壳聚糖污染最为严重（62,160 EU/g），AK Scientific 的污染程度最低（259 EU/g），而自制壳聚糖内毒素水平最低（20 EU/g）。
- 优化壳聚糖纯化条件：选择污染最严重的 MP Biomedicals 壳聚糖进行纯化条件优化。研究发现，1 N 和 3 N NaOH 处理 48 h 能有效降低内毒素水平，其中 1 N NaOH 处理 48 h 效果最佳，可将内毒素含量从 62,160 EU/g 降至约 600 EU/g，且对壳聚糖的 DDA 无明显影响，仅使 Mn 略有降低。
- 纯化方法对多种壳聚糖的有效性验证：将优化后的 1 N NaOH 处理 48 h 的纯化方法应用于所有壳聚糖样品，结果显示，所有样品内毒素含量均显著降低，最多可降低约 100 倍。同时，NMR 和 SEC - MALS 分析表明，纯化后壳聚糖的 DDA 保持稳定，Mn 略有下降，PDI 无明显变化，说明该纯化方法能有效去除内毒素并保留壳聚糖的结构完整性。
- 内毒素污染对巨噬细胞细胞因子释放的影响：体外研究表明，内毒素污染显著影响 J774A.1 巨噬细胞的细胞因子分泌。未纯化时，内毒素含量高的壳聚糖诱导巨噬细胞分泌更多的 IL - 1β、TNF - α 和 IL - 6；纯化后，这些细胞因子的分泌量显著降低，且不同壳聚糖纯化后的细胞因子反应相似，表明壳聚糖的结构性质对体外免疫反应影响较小，主要影响因素是内毒素污染。
综合研究结果和讨论，该研究意义重大。研究人员不仅揭示了商业壳聚糖在理化性质和内毒素污染方面存在的问题，还成功开发了一种简单有效的内毒素去除方法。该方法在确保有效降低内毒素水平的同时，最大限度地保留了壳聚糖的结构性质，为生物医学应用中壳聚糖的安全使用提供了有力保障。此外，研究结果也为解决壳聚糖免疫刺激机制的争议提供了新的视角，表明以往研究中部分免疫激活现象可能是由内毒素污染导致的。不过，该研究也存在一定局限性，其纯化方法仅在小规模实验中有效，尚未进行大规模验证，未来还需探索更适合大规模应用的技术，如切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF）技术等。总体而言，这项研究为壳聚糖在生物医学领域的进一步应用奠定了坚实基础，推动了该领域的发展。
