内吞栓系蛋白调控非经典分泌途径中GAPDH分泌的分子机制研究

本研究针对酵母细胞壁中缺乏信号肽的GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）非经典分泌机制展开探索，通过筛选基因缺失株并结合酶活性检测与显微成像技术，发现内吞体-溶酶体系统的CORVET/HOPS复合物及Rab5-GTP酶Vps21等关键因子显著影响GAPDH分泌。该研究揭示了MVB（多泡体）作为非经典分泌途径的重要枢纽，为理解病原真菌毒力因子分泌及哺乳动物类似通路提供了新视角。

　　

在真菌与哺乳动物细胞中，存在一类不依赖经典内质网-高尔基体途径的蛋白分泌方式，称为非经典分泌（Unconventional Protein Secretion, UPS）。这类途径对缺乏信号肽的蛋白（如代谢酶、热休克蛋白）的胞外转运至关重要，但其分子机制长期未明。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为模型的研究发现，糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）虽主要定位于胞质，却能在细胞壁中保持酶活，暗示其通过未知途径分泌。更引人注目的是，这类分泌蛋白在病原真菌（如白色念珠菌）中常作为毒力因子，其分泌机制可能与哺乳动物细胞因子（如IL-1β）的分泌共享进化保守通路。然而，驱动GAPDH这类"兼职蛋白"（moonlighting proteins）跨膜转运的具体细胞器与分子机器仍待阐明。

为破解这一谜题，来自Brooklyn College的研究团队在《The Cell Surface》发表论文，通过系统性筛选72个分泌相关基因缺失株，结合酶动力学分析与活细胞成像，首次揭示内吞体-溶酶体系统的栓系复合物（CORVET/HOPS）及Rab GTP酶Vps21对GAPDH分泌的关键调控作用。

研究主要采用四种关键技术：1）基于NADH生成的30分钟表面GAPDH活性检测（全细胞原位测定法），可特异性量化细胞壁关联酶活；2）生物素化阻断实验，通过膜不通透性生物素标记追踪分泌动力学；3）细胞壁蛋白DTT提取物活性分析，排除胞质污染干扰；4）TDH3-GFP与Snf7-RFP共定位的共聚焦显微术，直观示踪GAPDH的亚细胞定位。

3.1 基因缺失对细胞表面GAPDH活性的影响
筛选发现TDH3编码的GAPDH同工型贡献75%的壁酶活，而内吞栓系相关基因缺失影响最显著：Δvps21、Δbro1、Δvps41和Δpep12使活性降低40%以上，Δmuk1却使活性激增3.6倍。

3.2 CORVET和HOPS复合物的参与
CORVET（早期内吞体）特有组分Vps21缺失导致低分泌（活性0.4倍），而其GEF（鸟苷酸交换因子）Muk1缺失引发高分泌（3.6倍）。HOPS（晚期内吞体）特有组分Vps41缺失同样抑制分泌（0.43倍），提示两类栓系复合物协同调控分泌进程。

3.3 MVB形成机制的关联
ESCRT-III组分Bro1缺失使活性减半（0.51倍），而ESCRT-II组分Snf8缺失提升活性1.9倍。共聚焦显微证实GAPDH与MVB标志物Snf7共定位于胞内囊泡，支持MVB作为分泌"中转站"。

3.5 Δvps21/Δvps21酵母中GAPDH分泌延迟
生物素化实验显示Vps21缺失株的酶活恢复速率较野生型延迟，暗示其调控GAPDH进入分泌途径的"闸门"作用。

3.6 GAPDH在酿酒酵母中的定位
活细胞成像捕捉到TDH3-GFP与内吞染料FM4-64FX共定位，且在热休克30分钟后聚集于内吞体，Δvps21株则定位减弱，证实内吞途径的应激响应依赖性。

3.7 热休克后GAPDH分泌上调
41°C处理使野生型酶活提升4-6倍，而Δvps21和Δbro1株响应减弱50%，揭示应激分泌与内吞系统的功能耦合。

这项研究通过多维度实验首次阐明：内吞体-溶酶体系统（尤其是CORVET/HOPS-MVB轴）介导了约50%的GAPDH非经典分泌。Vps21作为关键调控节点，其缺失不仅延缓分泌动力学，还削弱热休克诱导的分泌爆发。值得注意的是，MVB依赖的分泌途径独立于自噬相关CUPS区室（Δatg5/7无影响），且与经典分泌途径（如sec1温度敏感株）无关。

该发现具有双重意义：在基础层面，揭示了代谢酶"兼职"分泌的细胞器基础，为理解UPS的进化保守性提供线索；在应用层面，Vps21、Bro1等靶点可能成为干预病原真菌毒力因子分泌的潜在位点。尤其当考虑到GAPDH在念珠菌属中的广泛分泌及其抗菌肽衍生能力，针对内吞栓系的调控或开辟抗真菌治疗新策略。未来研究可进一步解析GAPDH进入MVB的分子标签（如LYPXL基序）及其与Bro1的相互作用机制。