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本文聚焦嵌合抗原受体（CAR）疗法，探讨其从体外到体内生产的变革。介绍 CAR 结构、类型及治疗流程，对比体内外方法的优劣，阐述基因递送载体和编辑工具，分析临床应用及挑战，并展望未来发展，为 CAR 疗法研究提供全面参考。
1. 背景与引言
随着体内疗法在自身免疫和传染病治疗中的成功应用，其在癌症治疗领域的探索备受关注。嵌合抗原受体（CAR）疗法通过改造免疫细胞攻击肿瘤细胞，在血液恶性肿瘤治疗中取得一定成效，但体外生产 CAR - T 细胞面临制造误差、耗时久、成本高及技术员操作问题等挑战。为解决这些问题，基于载体携带 CAR 基因和基因编辑工具的体内生产方式应运而生，不过该方式也面临诸多挑战，需要深入研究。
2. CAR 结构、世代与类型
CAR 结构依据 Eshhars 团队的研究设计，其作用取决于所武装的免疫细胞类型。CAR 分为五代，不同代之间在细胞内结构域等方面存在差异，例如第一代缺乏细胞内结构域，第二代有一个，第三代有两个，第四代（TRUCKs）可产生细胞因子，第五代基于第二代并融入 IL - 2Rβ 结构域 ，各代 CAR 在抗肿瘤功能上不断进化。
CAR 类型多样，如 synNotch、双特异性等，不同类型的 CAR 针对癌细胞采用不同策略。例如，诱导型 CAR（Inducible CARs）可在免疫细胞基因组中保留 CAR 基因，在诱导剂作用下才启动表达，用于预防或治疗 CAR 疗法后的复发肿瘤 。目前获批的 CAR - 疗法药物多为第二代，未来药物有望采用新的 CAR 类型和结构以取得更好疗效。
3. CAR - 基于细胞的治疗：从实验室到临床实践
CAR - 基于免疫疗法的细胞治疗在临床前和临床研究中成果显著，已有多种药物获批用于治疗血液恶性肿瘤，全球还有众多相关研究正在开展。CAR - 治疗分为实验室和临床两个主要部分，实验室环节包括细胞采集、工程改造、扩增和转移等，需遵循良好生产规范（GMP），且各步骤的准确性和起始时间对治疗结果影响重大。例如，在血液癌症治疗中，较早使用基于 CAR 技术的药物，治疗效果更好。
除 T 细胞外，自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞、自然杀伤 T 细胞（NKT）等免疫细胞也可作为 CAR 的受体细胞。NK 细胞具有识别肿瘤细胞无需 MHC、反应迅速等优点，但存在转移率低、在血液中存活时间短等挑战；巨噬细胞对实体肿瘤治疗有潜力，因其在肿瘤微环境（TME）中渗透能力强，但存在数量有限且不增殖的问题；NKT 细胞可连接先天免疫和适应性免疫，在肿瘤抑制和免疫系统调节中发挥作用，但仍需更多临床研究验证其作为通用型药物的安全性和有效性 。
4. 从体外修饰到体内修饰
体外制造 CAR 产品需采集患者细胞，进行基因改造、扩增后回输患者体内，同时患者需进行淋巴细胞清除和 / 或桥接治疗（BT） 。该方法虽在血液恶性肿瘤治疗中取得进展，但存在细胞因子释放综合征（CRS）、移植物抗宿主病（GVHD）、成本高和制造时间长等问题 。为此，人们采取了一些改进策略，如使用同种异体 CAR - T 细胞、T 图表平台和微流体系统等，但仍无法完全解决问题。
体内生产 CAR - T 细胞药物可缩短治疗时间、降低成本且无需淋巴细胞清除。在体内编程过程中，利用病毒或非病毒载体将编码 CAR 基因的遗传物质导入 T 细胞，可使用不同分化阶段的 T 细胞，减少细胞因子暴露导致的细胞耗竭，降低感染风险和 CRS、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）的发生 。与现有 FDA 批准的体外 CAR - T 疗法相比，体内 CAR - T 疗法启动更快、成本可能更低，但两者都存在安全问题，且体内 CAR - T 疗法在实体肿瘤和免疫受损患者治疗方面具有优势。
5. 体内疗法的既往经验
体内基因疗法在多种疾病治疗中展现出潜力。例如，腺相关病毒（AAV）介导的基因疗法可用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）、脊髓性肌萎缩症（SMA）等遗传疾病，但存在免疫原性、包装容量有限和肝毒性等问题。NTLA - 2001 作为治疗转甲状腺素蛋白（TTR）相关遗传性淀粉样变性的体内基因修饰药物，通过脂质纳米颗粒（LNP）递送 CRISPR Cas9 RNA 降低有害蛋白积累。
在免疫细胞修饰方面，巨噬细胞的极化调控可作为抗肿瘤策略，如诱导 M2 巨噬细胞向 M1 型转化 。还有研究通过体内 CAR - T 细胞制造技术治疗心脏纤维化，虽取得一定效果，但存在成本高等问题。此外，体内 CAR - T 细胞疗法在 HIV 治疗中也有应用前景，可避免体外治疗的一些局限性 。
6. CAR - 基于体内疗法的基因递送和载体：CAR 的 “座驾”
在体内设计 CAR - T 细胞时，基因递送至关重要。基因递送系统分为病毒和非病毒载体。
病毒载体包括慢病毒（LV）、γ - 逆转录病毒和 AAV 等。LV 是常用的病毒载体，可通过伪型化进入多种细胞，具有较大包装容量，但存在转基因整合到非靶细胞的风险，如导致白血病细胞发生严重并发症。研究通过修饰 LV 载体，利用 CD3、CD4 和 CD8 等组件特异性靶向 T 细胞 。AAV 由非包膜蛋白衣壳携带单链 DNA（ssDNA），免疫原性较低，但包装容量有限，且在分裂细胞中基因表达会逐渐稀释，可能引发免疫反应和肝毒性 。噬菌体和病毒样颗粒（VLPs）也可作为载体，噬菌体安全性高，但相关研究较少；VLPs 结合了病毒载体的特异性和非病毒载体的递送优势，具有潜在应用价值 。
非病毒载体分为物理和化学两类。物理方法如电穿孔、基因枪等存在效率低、对细胞有损伤等问题；化学方法中，纳米材料如 LNPs、聚合物纳米颗粒等应用广泛。LNPs 可保护遗传物质、促进细胞递送，但存在肝积累和与 T 细胞结合成功率低等问题 。聚合物纳米颗粒可与遗传物质结合形成复合物促进基因递送，但可能存在免疫原性和毒性问题 。不同载体的 CAR 基因表达效率不同，且都面临脱靶效应和插入突变等挑战，可通过多种策略进行优化。
7. 体内 CAR 基因的各种载体和基因编辑工具
体内生产 CAR - T 细胞的方法分为传递遗传物质和使用基因编辑工具两类。遗传物质包括 mRNA、质粒 DNA（pDNA）和核糖核蛋白（RNP）等，它们通过载体进入靶细胞表达蛋白。mRNA 近年来备受关注，其具有无基因组整合风险、表达快速等优点，但存在易降解、需载体递送等问题 。pDNA 稳定性高，但存在基因组整合风险和表达缓慢等问题 。RNP 无需转录和翻译，作用迅速，但成本高、尺寸大、易降解 。
基因编辑工具如 CRISPR/Cas9、锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应核酸酶（TALENs）等可改变基因组，实现 CAR 基因的持久插入或修饰 。CRISPR/Cas9 系统是常用的基因编辑工具，由 Cas 蛋白和引导 RNA 组成，通过识别原间隔相邻基序（PAMs）切割 DNA 。但该系统存在脱靶效应、依赖 PAM 识别等问题。可通过选择合适的载体如 LNPs、外泌体等递送 CRISPR/Cas9 组件，同时开发新的基因编辑工具如 CASCLOVER，提高基因编辑的特异性和安全性 。
8. 体内 CAR 疗法在实验室和临床的应用
由于体外 CAR - T 细胞疗法存在高成本和长期副作用等问题，研究人员探索体内 CAR - T 细胞疗法的潜力。多项研究使用病毒载体或纳米颗粒在体内生成 CAR - T 细胞。例如，使用 LV 载体在小鼠模型中成功表达 CAR，清除 CD19+ B 细胞，但部分小鼠出现 CRS 副作用；AAV 载体可高效且特异性地将基因转移到 T 细胞，促进肿瘤消退 。
纳米颗粒在体内基因递送中具有优势，可负载不同有效载荷、便于系统修饰。多项研究表明，使用纳米颗粒递送 CAR 基因可有效激活 T 细胞，使肿瘤消退，且能降低制造时间、复杂性和成本，减少病毒载体相关的 CRS 问题 。
体内 CAR - T 细胞疗法不仅用于癌症治疗，还可探索用于自身免疫疾病、传染病和心脏损伤等疾病的治疗。不过，目前使用 CRISPR 进行体内 CAR - T 细胞生产的研究较少，未来可通过优化基因编辑技术和载体递送系统，提高体内 CAR - T 细胞疗法的疗效和安全性。
9. 体内细胞疗法的适应症：癌症及其他疾病
体内 CAR - T 细胞疗法虽有优势，但并非适用于所有患者。治疗需要强大的基因转移复合物和宿主免疫系统，然而目前缺乏相关治疗标准的研究和指南。免疫细胞的数量和质量会影响治疗效果，例如慢性疾病和老年患者的免疫细胞质量可能较差，肿瘤细胞对免疫系统的抑制也会降低免疫细胞对 CAR 结构的利用能力 。
在癌症治疗中，血液恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等对体内 CAR - T 细胞疗法反应良好，因其肿瘤细胞易于接触，且不存在物理屏障阻碍 CAR - T 细胞激活和扩增 。而实体肿瘤如胶质母细胞瘤、胰腺癌和卵巢癌等，由于存在免疫抑制性肿瘤微环境、物理屏障和抗原异质性等问题，对体内 CAR - T 细胞疗法构成挑战，但新型靶向非病毒载体有望改善这一状况 。
10. 体内 CAR - T 细胞疗法面临的挑战与解决方案
体内 CAR - T 细胞疗法面临诸多挑战。对体内细胞的修饰和扩增控制有限，可采用先进的监测技术如实时成像或生物标志物追踪来解决；存在脱靶效应，可通过引入安全开关或双靶向策略提高 CAR - T 细胞对癌细胞的特异性；患者免疫系统可能清除修饰的 T 细胞，可联合免疫调节药物或检查点抑制剂增强修饰 T 细胞的持久性和有效性 。
肿瘤负担、先前治疗和免疫状态会影响体内 CAR - T 细胞疗法的疗效。高肿瘤负担会阻碍 CAR - T 细胞扩增和存活，先前治疗可能改变免疫环境，影响疗法效果，患者免疫状态和白血病细胞抗原表达也至关重要 。可通过优化 CAR 构建体设计、增强 T 细胞扩增方案或引入共刺激分子等方式，提高体内修饰 T 细胞的效力和功能 。
此外，体内 CAR - T 细胞疗法还存在安全问题，如 CRS、神经毒性等。需要严格监测患者、制定早期干预策略和个性化给药方案，同时开展长期随访和非人类灵长类动物研究，评估治疗的安全性和有效性，确定合适的患者选择标准，以推动该疗法的临床应用 。
11. 结论与未来方向
体内 CAR 疗法是一种创新的治疗策略，相比传统体外 CAR - T 细胞疗法，具有治疗速度快、安全性高和劳动强度低等优势，但在基因递送精准性、免疫反应调控和修饰细胞行为预测等方面存在挑战。病毒载体基因递送存在免疫原性和毒性风险，非病毒载体如纳米颗粒虽有潜力，但在稳定性、生物相容性和转染率等方面有待提高 。
未来研究应聚焦于改进非病毒递送方法，结合 CRISPR 和 Cas - CLOVER 等基因编辑技术，减少脱靶效应，提高 CAR 在靶细胞中的表达。同时，利用人工智能（AI）和机器学习优化患者选择、设计更特异性的 CAR 和确定最佳基因递送方法 。随着技术的不断进步，体内 CAR 疗法有望成为治疗癌症及其他疾病的有效手段。
