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基因组编辑在植物生物学领域意义重大，但编辑系统导入植物困难重重。研究人员利用烟草脆裂病毒（TRV）搭载紧凑的 RNA 引导 TnpB 酶 ISYmu1 及其引导 RNA，实现拟南芥一步法无转基因编辑且可遗传。这为植物基因组编辑提供新平台，加速相关研究。
在植物生物学的研究进程中，基因组编辑宛如一把神奇的 “分子剪刀”，能够对植物的 DNA 进行精确修改，为创造理想的植物性状、推动植物生物技术发展带来了无限可能。然而，这把 “剪刀” 想要精准地递送到植物细胞内部，却困难重重。当前，将编辑系统导入植物的常用方法，如组织培养或转化，不仅耗时费力，而且高度依赖植物的基因型，就像一把钥匙只能开特定的几把锁，适用范围十分有限。同时，这些方法还可能在不经意间对植物的基因组和表观基因组造成意想不到的改变，就如同在精密的仪器上随意调整旋钮，可能引发未知的故障。
为了攻克这些难题，来自美国加利福尼亚大学洛杉矶分校（University of California at Los Angeles）、加利福尼亚大学伯克利分校（University of California, Berkeley）等机构的研究人员展开了深入研究。他们将目光投向了植物病毒，这些在植物界广泛存在的 “小生命”，天然具有感染并传播到植物大多数组织的能力，就像是一群熟悉植物 “地形” 的 “快递员”，能否利用它们来运输基因组编辑试剂呢？研究人员对此进行了大胆尝试。
研究人员选择了烟草脆裂病毒（TRV），并对其进行改造，使其能够携带超紧凑的 RNA 引导核酸内切酶 TnpB 中的 ISYmu1 及其引导 RNA。经过一系列精心设计的实验，他们成功实现了利用改造后的 TRV 在拟南芥中进行无转基因编辑，并且这种编辑能够稳定地遗传到下一代。这一研究成果发表在《Nature Plants》上，为植物基因组编辑领域开辟了全新的道路。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是构建多种质粒用于不同实验，如细菌干扰实验、原生质体和花浸染实验等；二是进行细菌干扰实验，检测 TnpB 和引导 RNA 在细菌中的活性；三是通过原生质体分离与转染，研究 TnpB 在拟南芥原生质体细胞中的编辑能力；四是利用农杆菌介导的转化方法（如农杆菌浸润法 agroflood）将 TRV 载体递送至拟南芥幼苗；五是运用下一代扩增子测序（amp-seq）和全基因组测序等技术，分析编辑效率、DNA 修复情况以及脱靶效应 。
一、TnpB 和引导 RNA 在单转录本中的表达及活性检测
研究人员首先在细菌中测试了 TnpB 和其引导 RNA 在单转录本中的表达活性。他们将 TnpB 和引导 RNA 从同一启动子以单转录本形式共表达，对比了 3’ - 引导区域两种不同构型：一种是无终止子连续延伸以模拟天然 TnpB 条件，另一种是由丁型肝炎病毒（HDV）核酶终止。结果显示，在有 HDV 核酶的情况下，ISDra2、ISYmu1 和 ISAam1 这三种 TnpB 在 26°C 和 37°C 均展现出较强的质粒干扰活性，这表明含有 HDV 核酶序列的单转录本表达盒能够在细菌中切割质粒 DNA。
二、TnpB 在拟南芥原生质体细胞中的靶向基因组编辑
为了进一步探究 TnpB 在植物细胞中的编辑能力，研究人员使用 AtUBQ10 启动子驱动 TnpB - ωRNA 和靶向 PHYTOENE DESATURASE3（AtPDS3）基因区域的引导 RNA 表达，在拟南芥原生质体细胞中进行实验。结果发现，ISDra2 和 ISYmu1 分别展现出 0 - 4.8% 和 0.1 - 4.2% 的编辑活性，ISAam1 编辑效率较低，为 0 - 0.3%。平均而言，ISDra2 编辑效率为 1%，ISYmu1 为 2.1%，ISAam1 为 0.1%，且三种 TnpB 的 DNA 修复均以缺失为主。这说明 ISDra2、ISYmu1 和 ISAam1 利用单转录本表达设计，均能够在拟南芥植物细胞中实现靶向基因组编辑。
三、ISYmu1 在转基因拟南芥植物中的编辑效果
鉴于 ISYmu1 在拟南芥原生质体细胞中表现出较高的平均编辑效率，且在水稻中无脱靶编辑现象，研究人员选择它进一步在转基因拟南芥植物中进行研究。他们挑选了两个编辑活性最强的引导 RNA，分别靶向 AtPDS3 基因的编码区和启动子区域，通过标准的花浸染转化法创建转基因植物。实验发现，在野生型（WT）和 rna dependent rna polymerase 6（rdr6）突变体（该突变体转基因沉默减少）中，不同引导 RNA 的编辑效率有所差异。同时，热激处理和 rdr6 突变体能够提高编辑效率，编辑结果呈现出以缺失为主的嵌合 DNA 修复模式。这表明作为转基因编码的 ISYmu1 能够在拟南芥植物中高效进行基因组编辑。
四、TRV 介导的 ISYmu1 基因组编辑及编辑等位基因的遗传
研究人员构建了两种 TRV2 载体结构（Architecture_A 和 Architecture_B），用于测试 TRV 介导的 ISYmu1 在拟南芥中的基因组编辑能力。以靶向 AtPDS3 编码序列的 gRNA2 为研究对象，通过农杆菌浸润法将 TRV 载体递送至 WT 和 ku70 突变体拟南芥植物。结果显示，Architecture_B（含有 HDV 核酶）的编辑效率高于 Architecture_A，ku70 突变体能够增强编辑效率。进一步对编辑等位基因的遗传进行检测，研究人员发现，经 TRV 递送 ISYmu1 产生的编辑可以稳定遗传到下一代，且在后代中检测不到 TRV 病毒，这表明 TRV 介导的双等位基因编辑是可遗传且无病毒残留的。
五、TRV 介导的 ISYmu1 在其他基因位点的编辑及脱靶分析
研究人员设计了靶向 AtCHLl1 基因的 ISYmu1 引导 RNA，利用 TRV Architecture_B 载体进行编辑实验。结果显示，在 AtCHLl1 基因的多个靶位点均能产生靶向体细胞突变，且编辑等位基因可遗传至下一代。此外，通过对 ISYmu1 TRV2 Architecture_B gRNA2 产生的双等位基因突变的白化植株进行全基因组测序，研究人员发现 ISYmu1 具有较高的靶点特异性，潜在的脱靶变异极少。
综上所述，该研究成功利用 TRV 递送 RNA 引导的基因组编辑器 ISYmu1，实现了拟南芥的无转基因生殖系编辑。这一成果突破了传统编辑试剂递送的障碍，为植物基因组编辑提供了一种全新的平台。它不仅能够大大加速植物生物技术和基础研究的进程，还为未来在更多植物物种中进行高效基因组编辑开辟了新途径，有望在作物改良、植物基因功能研究等多个领域发挥重要作用，推动植物科学领域取得更多创新性的成果。
