基于药物重定位策略筛选SARS-CoV-2 3CL蛋白酶抑制剂：从计算机模拟到体外验证

为解决COVID-19治疗药物开发难题，伊斯坦布尔大学团队通过计算机辅助药物设计筛选3498种FDA批准药物，结合体外酶活实验和亚基因组复制子系统，发现氨苯砜（lumacaftor）、坎地沙坦（candesartan）和奈非那韦（nelfinavir）可有效抑制SARS-CoV-2 3CLpro酶活（IC50达纳摩尔级），双药联用方案更将抗病毒活性提升2-6倍，为临床抗COVID-19治疗提供新策略。

　　

新型冠状病毒SARS-CoV-2的持续变异对全球公共卫生构成严峻挑战，尽管已有Paxlovid等抗病毒药物获批，但开发广谱、低毒且可快速临床转化的治疗方案仍是当务之急。其中，病毒3CL蛋白酶（3CLpro）因其在病毒生命周期中的核心作用——负责切割病毒多聚蛋白产生功能性非结构蛋白，且人类缺乏同源蛋白，成为理想药物靶点。然而传统药物开发周期长、成本高，而通过"老药新用"（drug repurposing）策略筛选已有临床用药，可大幅缩短研发进程。

针对这一需求，伊斯坦布尔大学Betül Orucoglu等研究人员开展了一项多学科交叉研究，通过计算机虚拟筛选、分子动力学模拟、体外酶活抑制实验和基于BSL-2安全条件的亚基因组复制子（subgenomic replicon）系统，对3498种FDA批准药物进行系统性评价。研究发现氨苯砜、坎地沙坦等药物不仅能有效抑制3CLpro活性（最低IC₅₀达0.3 μM），在细胞模型中更展现出纳摩尔级抗病毒效果，双药联用方案可产生显著协同效应。该成果发表于《Scientific Reports》，为COVID-19临床治疗提供了具有即时转化潜力的候选方案。

研究团队采用四大关键技术方法：1）基于AutoDock Vina的分子对接和100 ns分子动力学（MD）模拟预测药物-3CLpro结合模式；2）使用3CL Protease Assay Kit进行体外酶活抑制实验；3）构建ΔS-Luc-GFP亚基因组复制子系统（由爱荷华大学馈赠）在Caco-2/Calu-3细胞系评估抗病毒活性；4）通过xCELLigence RTCA-DP系统实时监测细胞毒性。

研究结果
实时细胞毒性监测
通过阻抗法测定27种候选药物在肺腺癌（Calu-3）和结肠癌（Caco-2）细胞系中的安全浓度范围，排除匹莫齐特（pimozide）等药物在50 μM时的细胞毒性干扰。

3CLpro体外酶活抑制
10种药物在50 μM浓度下抑制率超50%，其中氨苯砜（B5）表现最优（IC₅₀=0.30 μM）。坎地沙坦（Cnd）和氨苯砜（B22）分别达15.6 μM和13.7 μM。分子动力学显示这些药物通过羧基与His41/Met49等活性位点氨基酸形成稳定相互作用。

组合用药协同效应
固定坎地沙坦（5 μM）时，联用200 nM氨苯砜或艾曲波帕（eltrombopag）可使抑制率提升50%以上。MD模拟证实双药能同时占据3CLpro不同亚位点，阻断底物通道。

亚基因组复制子验证
在类肠上皮（Caco-2）细胞中，坎地沙坦和氨苯砜单药IC₅₀分别为714 nM和964 nM；在肺上皮（Calu-3）细胞中分别达1.05 μM和458 nM，显著优于阳性对照GC376（7.8 μM）。

讨论与意义
该研究首次系统证实抗纤维化药氨苯砜（CFTR调节剂）和降压药坎地沙坦（AT1受体拮抗剂）具有双重作用机制：既通过直接抑制3CLpro阻断病毒复制，又可能调节宿主细胞因子风暴。尤其值得注意的是，这些药物已有完善的临床安全性数据，其中坎地沙坦更因能下调ACE2表达具有独特优势。研究者特别指出，基于复制子系统建立的BSL-2安全实验平台，为在普通实验室开展高水平抗病毒研究提供了技术范本。未来研究将聚焦于动物模型验证和临床试验设计，有望为COVID-19特别是长期感染（long COVID）患者提供新的治疗选择。