套索肽RES-701-3结合ETB受体的冷冻电镜结构揭示GPCR反向激动机制

本研究通过冷冻电镜解析了套索肽RES-701-3与内皮素B型受体(ETB)的复合物结构，揭示了其通过疏水相互作用稳定受体非活性构象的反向激动机制。该研究为开发靶向ETB的肿瘤免疫治疗药物提供了结构基础，并拓展了套索肽在GPCR靶向药物设计中的应用前景。

　　

内皮素B型受体(ET_B)作为G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员，在血管调节和肿瘤微环境调控中发挥关键作用。其过度表达会导致肿瘤免疫"冷"表型，使患者对免疫治疗产生抵抗。虽然小分子抑制剂如BQ-788已被开发，但存在选择性不足(ET_B/ET_A≈20倍)和半衰期短等问题。源自链霉菌的套索肽RES-701-3展现出对ET_B的纳摩尔级抑制活性和超高选择性(ET_B/ET_A>1000倍)，但其作用机制长期未知。

东京大学等机构的研究人员通过异源表达系统突破产量瓶颈，采用钙调磷酸酶(CN)融合策略成功解析了RES-701-3-ET_B复合物的3.3?冷冻电镜结构。研究发现RES-701-3通过W¹⁰和F¹¹等芳香族残基与受体跨膜区形成1078?²的相互作用界面，其独特的"环-尾"结构使C端朝向外周而疏水环深入结合口袋。更重要的是，该肽通过阻止W₃₃₆^6.48侧链旋转，抑制了GPCR激活必需的构象变化，首次从结构上阐明其反向激动机制。该成果发表于《Nature Communications》，为开发靶向ET_B的肿瘤免疫治疗药物提供了新思路。

关键技术包括：1) 采用Streptomyces venezuelae异源表达系统实现RES-701-3毫克级产量；2) 通过CN-A/CN-B三处融合稳定GPCR构象；3) 冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物结构；4) TGFα脱落实验验证反向激动活性；5) 竞争结合实验测定突变体亲和力。

【RES-701-3及其类似物的生产】
研究人员在Streptomyces venezuelae中重构RES-701-3生物合成基因簇（lasA-C），产量达12 mg/L，较天然宿主提高60倍。通过定点突变获得28种变体，为结构-活性关系(SAR)研究奠定基础。

【RES-701-3药理学特性】
放射性配体结合实验证实RES-701-3对ET_B的IC₅₀为31.5 nM，且对ET_A无活性。TGFα脱落实验显示其能降低ET_B-L193^3.43Q组成型激活突变体的基础活性(EC₅₀=43 nM)，首次明确其反向激动剂属性。药代动力学分析显示其在小鼠体内半衰期超6小时，显著优于小分子抑制剂BQ-788。

【结构解析】
采用CN融合策略克服GPCR柔性难题，通过冷冻电镜获得apo和RES-701-3结合ET_B的3.3?结构。发现CN-B与受体胞内面形成711?²的静电相互作用界面，远超传统融合蛋白（如A_2A-BRIL仅307?²）。

【RES-701-3结合模式】
结构显示RES-701-3的G¹-D⁹异肽键形成9残基环，C端穿过该环形成"套索"拓扑。关键残基W³嵌入TM7的Y¹⁵疏水口袋，W¹⁰/F¹¹与TM5/TM6相互作用。突变实验证实W3A等突变导致亲和力下降超100倍，与结构观察一致。

【反向激动机制】
与激动剂ET-1诱导的TM6内移不同，RES-701-3通过W¹⁰将W₃₃₆^6.48侧链向外旋转，阻止其与F₃₃₂^4.44相互作用，从而抑制P^5.50I/V^3.40F^6.44基序构象变化。这种独特的"构象锁定"机制解释了其反向激动活性。

该研究首次揭示套索肽靶向人类GPCR的结构基础，阐明了RES-701-3通过"双Trp锚定"（W³和W¹⁰）实现高选择性和反向激动活性的分子机制。所开发的CN融合策略为柔性膜蛋白结构解析提供新方法。从转化医学角度看，该成果不仅为克服ET_B介导的肿瘤免疫抵抗提供了精准靶向工具，更拓展了套索肽在GPCR药物开发中的应用范式，其"环-尾"拓扑结构为设计新型受体调节剂提供了创新模板。