揭秘 Vps34 在视网膜色素上皮细胞中的关键作用：吞噬、自噬与内吞的分子机制

本文聚焦视网膜色素上皮（RPE）细胞，研究 III 类磷脂酰肌醇 3 - 激酶（Vps34）及其产物磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI (3) P）在 RPE 细胞吞噬、自噬和内吞中的作用。发现 Vps34 - PI (3) P 对 RPE 细胞功能至关重要，其缺失会引发细胞异常，为相关眼病研究提供新视角。

　　

研究背景

磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI (3) P）在真核生物膜运输中意义重大，参与自噬、内体和吞噬体处理等过程，还是磷脂酰肌醇 - 3,5 - 二磷酸（PI (3,5) P₂）的前体，对细胞器降解不可或缺。视网膜色素上皮（RPE）细胞紧邻脊椎动物视网膜光感受器层，其吞噬、内吞和自噬功能对维持光感受器健康和视觉至关重要。例如，RPE 细胞通过吞噬光感受器外段（POS）远端尖端实现外段内容物的持续更新，内吞作用可摄取营养物质和捕获视黄醇，自噬在 RPE 中的作用近年来也备受关注，且与年龄相关性黄斑变性（AMD）可能相关。然而，PI (3) P 在 RPE 细胞吞噬 POS 过程中的作用尚未明确，本研究旨在探究 PI (3) P 和 Vps34 在 RPE 细胞中的功能及相互作用。

研究方法

1. 细胞培养与处理：培养人视网膜色素上皮细胞系 ARPE - 19，用氯喹处理增强自噬体可见性，用 Vps34 抑制剂 Vps34 - IN1 研究 Vps34 和 PI (3) P 在吞噬作用中的作用，同时设置对照处理。
2. 动物实验：构建 RPE 特异性条件性敲除 Vps34 的小鼠模型（ΔRPE），将其与表达人视紫红质 - EGFP 的小鼠杂交，以便观察 POS 吞噬体。通过亚视网膜注射和电穿孔将质粒导入小鼠 RPE 细胞，用于定位 PI (3) P。对小鼠进行免疫荧光染色、荧光成像和透射电子显微镜（TEM）分析，以研究细胞结构和功能变化。
3. 检测方法：利用表达 PI (3) P 结合结构域融合蛋白的质粒（如 GFP - 2xHrs）可视化 PI (3) P 膜，通过免疫荧光染色检测各种蛋白标记物，用 TEM 观察细胞内超微结构。

研究结果

1. PI (3) P 在培养的人 RPE 细胞中的定位：在 ARPE - 19 细胞中，PI (3) P 标记的膜泡与内质网、顺式高尔基体标记物不共定位，与反式高尔基体（TGN46）、早期内体（Rab5）和晚期内体（Rab7）部分共定位，表明存在多个 PI (3) P 膜池。氯喹处理后，自噬标记物 LC3/Atg8 等积累，PI (3) P 与 LC3 不真正共定位，部分 LC3 标记的聚集体缺乏 PI (3) P 信号。在吞噬实验中，Vps34 活性和 PI (3) P 对吞噬起始非必需，但对 LC3 招募至关重要。
2. PI (3) P 在小鼠眼 RPE 细胞中的定位：在野生型（WT）小鼠 RPE 中，PI (3) P 存在于两种膜结构中，一种是围绕 POS 吞噬体的大环形结构，另一种是可能为内体的小囊泡。小 PI (3) P 标记的囊泡不与自噬标记物 p62 共定位。
3. Vps34 敲除对 RPE 细胞功能和形态的影响：ΔRPE 小鼠 RPE 细胞缺乏 PI (3) P 标记的斑点，出现大量自噬标记物积累，细胞形态和功能异常，如 RPE65 和紧密连接标记物染色缺失，细胞死亡，相邻光感受器外段结构破坏。电镜观察发现，ΔRPE 小鼠 RPE 细胞积累大量异常膜聚集体，包括未消化的 POS 吞噬体和多层膜结构，类似 “停滞” 的自噬相关膜。
4. 其他相关发现：在 Vps34 敲除的 RPE 细胞中，未消化的 POS 吞噬体大量积累，且不与 EEA1、LC3、LAMP2 和 Rab7 共定位。自噬标记物在 Vps34 敲除的 RPE 细胞中大量积累，且密度随年龄增加。此外，Vps34 敲除的 RPE 细胞中，虽无吞噬体相关 LC3，但溶酶体大量上调，表明存在 LC3 非依赖的溶酶体生物发生机制。

研究结论

1. Vps34 和 PI (3) P 对 LC3 招募的作用：Vps34 催化活性和 PI (3) P 是招募 LC3 到吞噬体所必需的，这与 LC3 可在无 Vps34 - 来源 PI (3) P 情况下被招募到含自噬标记物的新生膜形成对比，说明 RPE 细胞中自噬和吞噬过程中 LC3 招募机制存在差异。
2. PI (3) P 与吞噬起始的关系：PI (3) P 和 LC3 招募对 RPE 细胞吞噬 POS 的起始阶段并非必需，吞噬起始可能依赖 I 类 PI - 3 激酶活性和 PI (3,4,5) P₃合成，吞噬杯富含 PI (4,5) P₂。
3. LAP 与自噬的关系：LC3 相关吞噬作用（LAP）不能被准确描述为 “非经典自噬”，LAP 与自噬是不同且相互竞争的途径。在 RPE 细胞中，吞噬作用激活 mTORC1 抑制自噬，而自噬体在无 PI (3) P 情况下仍可招募 LC3 并转化为 LC3 - II，且吞噬体与自噬体的特征标记物不同。
4. POS 吞噬过程的顺序：POS 吞噬和内化先于 Vps34 招募、PI (3) P 合成和 LC3 招募，溶酶体上调不依赖 LC3 招募，但吞噬体成熟、加工，如沿微管运输、与内体或溶酶体融合及最终降解，依赖活性 Vps34 和 PI (3) P。
5. Vps34 对自噬的作用：Vps34 对正常自噬的起始和完成至关重要，但对含碎片的双层和多层膜形成、LC3 招募到非吞噬体膜、LC3 - II 形成及 Atg9、p62 和泛素化货物招募并非必需，导致自噬相关结构积累，但正常自噬无法进行。

研究局限

本研究受现有工具限制，电子显微镜鉴定的膜聚集体与抗体染色鉴定的是否相同缺乏确凿证据，通过抗体染色鉴定膜结构也存在不确定性。此外，由于条件性敲除的镶嵌性和时间依赖性，对表型随时间的进展及其精确分子机制缺乏确定性。

尽管存在局限，本研究为理解 RPE 细胞中吞噬、自噬和内吞过程的分子机制提供了重要见解，有助于进一步研究相关眼病的发病机制，为开发潜在治疗策略奠定基础。未来研究可进一步探究 Vps34 和 PI (3) P 在 RPE 细胞中的详细作用机制，以及寻找干预相关疾病的新靶点 。