Toti-N - 聚糖识别：开启单细胞和单细胞核 RNA 测序新纪元

《Research》：Toti-N-glycan Recognition Enables Universal Multiplexed Single-Nucleus RNA Sequencing

当前样本条形码技术在单细胞和单细胞核测序（sc/sn-seq）存在不足。研究人员开展 Toti-N-Seq 技术研究，成功实现通用样本多重标记，分类准确率高、能去除假象、检测稀有细胞群。该技术为相关研究提供新平台。

　　在生命科学的探索之路上，单细胞和单细胞核测序（sc/sn-seq）技术宛如一座灯塔，照亮了我们深入了解细胞奥秘的征程。它能够解析单个细胞的基因表达情况，帮助科学家们洞悉细胞间的差异以及细胞在复杂生物系统中的独特作用。然而，随着研究的不断深入，现有的样本条形码技术在 sc/sn-seq 中暴露出诸多问题。比如，基于蛋白质标记的方法，依赖目标蛋白在不同细胞类型中的普遍表达，可寻找这样的 “全能” 目标蛋白困难重重；脂质锚定标记虽应用广泛，但条形码与细胞或细胞核表面脂质的亲和力较弱且不稳定，容易引发脱靶效应和交叉污染。此外，遗传细胞标记不仅在不同细胞类型中的效率参差不齐，还需要长时间的预处理，甚至可能带来类似化学标记的 “副作用” 扰动。这些问题严重限制了样本条形码技术的通用性，阻碍了 sc/sn-seq 技术进一步发挥潜力。

为了突破这些困境，来自未知研究机构的研究人员踏上了探索之旅，致力于开发一种更为高效、通用的样本多重标记技术。经过不懈努力，他们成功研发出 Toti-N-Seq 技术。这一技术的问世，为 sc/sn-seq 领域带来了新的曙光，其研究成果发表在《Research》杂志上。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过基因工程手段构建并表达了链霉亲和素 - Fbs1 GYR 变体（Stv–Fg）融合蛋白，用于识别和标记 N - 聚糖；其次，利用质谱分析、荧光成像、流式细胞术等技术对标记性能进行评估；最后，借助基于液滴的微流控技术进行单细胞和单细胞核 RNA 测序实验，分析样本的基因表达情况 。

下面来详细看看这项研究的结果：

• Toti-N-Seq 技术概述：Toti-N-Seq 技术的核心在于通过识别细胞膜或核膜上的 Toti-N - 聚糖，实现用 DNA 条形码标记细胞或细胞核。研究人员利用天然蛋白 Fbs1 能识别 N - 聚糖核心五糖基序（Man₃GlcNAc₂）的特性，对其进行改造得到 Fbs1 GYR 变体（Fg） ，并将其与链霉亲和素融合，构建出 Stv–Fg 融合蛋白。该融合蛋白可与生物素修饰的寡核苷酸条形码相连，从而实现对细胞或细胞核的标记。同时，Toti-N-Seq 样本条形码包含特定的寡核苷酸序列，在逆转录过程中与转录本相连，便于后续的样本解复用和文库构建。
• Toti-N - 聚糖条形码标记性能的生化评估：质谱分析显示，Stv–Fg 融合蛋白能够在复杂的生物大分子背景下，准确且无偏地识别标准糖蛋白（RNase B）中的 N - 聚糖。荧光成像实验表明，与传统的细胞膜标记染料 DiI 相比，Toti-N - 聚糖荧光条形码在标记细胞膜时，不仅能更均匀地标记每个细胞，还能减少对细胞内脂质结构的非特异性标记；在标记细胞核方面，与 Hoechst 共染的结果显示，Toti-N - 聚糖荧光条形码能清晰勾勒出细胞核边界，且不会影响对核内 DNA 的观察。此外，流式细胞术实验证实，Toti-N - 聚糖荧光条形码可以成功标记多种来自不同物种的细胞类型，并且在低浓度下（细胞膜标记低至 37.5 pM，细胞核标记低至 75.0 pM）就能实现高效标记。在样本混合实验中，即使混合孵育 90 分钟，不同样本间的交叉污染也极低，充分证明了该技术在样本标记过程中的高保真度。
• Toti-N - 聚糖条形码用于混合样本的 sc/sn-seq：研究人员以 HEK293T 细胞和 NIH 3T3 细胞为模型，进行了原理验证实验。结果显示，Toti-N - 聚糖 DNA 样本条形码能够成功对混合样本进行解复用，根据不同细胞类型的基因表达谱，准确区分不同样本来源的细胞或细胞核。在评估技术对混合样本比例的保真度实验中，研究人员将多种不同细胞样本按 1:1 比例混合，经 Toti-N-Seq 技术处理后，检测到的样本比例偏差始终低于 4%，确保了在不同细胞类型间的测序深度均衡。此外，该技术在区分细胞或细胞核双联体方面表现出色，通过样本条形码检测和后续计算工具验证，将单细胞测序（sc-seq）和单细胞核测序（sn-seq）中的双联体比例分别降低至 0.04% 和 0.02% ，显著提高了数据质量。在评估样本分类准确性时，研究人员采用总体分类准确率（OCA）指标，结果显示 sc-seq 的 OCA 达到 0.969，sn-seq 的 OCA 更是高达 0.987，远超基于蛋白质或脂质标记的 sc/sn-seq 技术。
• 多重单细胞核 RNA 测序（sn-RNA-seq）：研究人员进一步测试了 Toti-N - 聚糖多重 sc/sn-seq 技术在同型和异型细胞群体中的可扩展性。在 6 重和 12 重 sn-seq 实验中，分别将不同数量的 HEK293T 细胞、MDA-MB-231 细胞和 MCF7 细胞样本混合。结果发现，不同类型的细胞核能够根据基因表达矩阵和特征差异表达基因（DEGs）清晰地分离和聚类，且 Toti-N - 聚糖条形码能准确标记不同样本，未出现明显的交叉标记现象。从基因表达热图可以看出，随着多重 sn-seq 规模的扩大，每个标记组的测序细胞核数量相似，表明该技术在标记不同样本时具有高度的保真度，能够在保持样本属性的同时实现均匀测序。
• Toti-N - 聚糖条形码对人外周血单个核细胞（PBMC）亚群的解复用：在动物研究和临床研究中，样本往往包含多种细胞类型且细胞群体分布不均衡，检测稀有细胞群是一大挑战。研究人员利用 Toti-N - 聚糖条形码对人 PBMC 进行解复用实验。在绘制的基因表达空间图中，不同细胞类型（如 CD14⁺单核细胞、CD16⁺单核细胞、CD4⁺T 细胞等）能够准确分类，Toti-N - 聚糖标签在各细胞群体中均匀分布。通过分析不同细胞类型的特征基因表达，研究人员发现 Toti-N-Seq 技术成功检测到了稀有细胞类型，如浆细胞样树突状细胞（pDCs），其在样本中的比例低至 0.5% - 1.3%，且细胞双联体比例仅为 0.6%。这一结果充分证明了该技术在检测稀有细胞方面的可靠性，并且该技术同样适用于小鼠 PBMC 以及混合的人鼠样本，展现出其在不同物种样本中的通用性。

综上所述，Toti-N-Seq 技术凭借其独特的 N - 聚糖标记策略，成功克服了传统样本条形码技术的诸多弊端，为单细胞和单细胞核 RNA 测序带来了显著的改进。它不仅实现了对多种细胞类型和物种的通用标记，而且在准确性、效率和可扩展性方面表现卓越。该技术能够精准检测稀有细胞类型，有效减少批次效应，极大地提升了数据的可靠性和可获取性，为生物医学领域的前沿研究提供了强大的技术支持。在未来，Toti-N-Seq 技术有望推动大规模研究、多组学整合以及转化医学应用的发展，助力科学家们在基础研究和临床实践中取得更多突破性进展，让我们对生命奥秘的认知迈向新的高度。