利用Target-AID碱基编辑技术鉴定 Streptomyces lavendulae FRI-5中多烯大环内酯lavencidin生物合成的关键基因

这篇研究通过Target-AID（激活诱导胞苷脱氨酶）碱基编辑技术，在 Streptomyces lavendulae FRI-5中精准鉴定并功能验证了lavencidin生物合成基因簇（lad），揭示了其28元环多烯大环内酯的I型模块化聚酮合酶（PKS）组装机制。该工作为理性设计新型抗真菌药物提供了分子基础，同时证明了Target-AID系统在链霉菌遗传操作中的高效性和普适性，为天然产物挖掘和合成生物学研究提供了有力工具。

　　

Target-AID碱基编辑系统的构建与验证
研究团队开发了新型Target-AID载体pLK101，该载体整合了dCas9-胞苷脱氨酶融合蛋白（dCas9-CDA-UL_str）和强启动子ermE*P驱动的sgRNA表达系统。通过在模式菌株 Streptomyces coelicolor A3(2)中靶向编辑actI-ORF2基因（聚酮链长度因子），成功引入终止密码子，导致蓝色抗生素放线紫红素（ACT）合成缺失，而红色抗生素灵菌红素（RED）不受影响。测序证实所有突变株均在靶位点实现C-to-T编辑，编辑效率达100%。

系统在非模式链霉菌中的适用性
针对 Streptomyces lavendulae FRI-5特有的蓝色色素吲哚苷（indigoidine）合成基因lbpA，研究设计了靶向硫酯酶（TE）结构域的sgRNA。突变株mlbpA完全丧失色素合成能力，液相培养中IM-2激素诱导后仍无产物积累。该结果首次证明pLK101在GC含量极高的非模式链霉菌中具有高效编辑能力。

lavencidin生物合成基因簇的鉴定
通过基因组挖掘和antiSMASH分析，在S. lavendulae FRI-5中定位了100.7 kb的候选基因簇（lad），包含5个I型PKS基因（ladA1-A5）、3个调控基因（ladR1-R3）及3个修饰基因（ladB1-B3）。靶向编辑ladA5的TE结构域后，突变株mladA5完全丧失lavencidin及其类似物RKGS-A2215A的合成能力，证实该簇负责28元环多烯大环内酯的生物合成。

聚酮组装线的独特特征
生物信息学分析揭示lad PKS包含14个模块、64个功能域。值得注意的是：

1. 加载模块的KS_L缺乏保守催化三联体，可能通过GNAT家族乙酰转移酶（Orf4）直接加载乙酰基；
2. AT结构域进化树显示模块1/7/13特异性识别甲基丙二酰-CoA，而模块2-6/8-12偏好丙二酰-CoA；
3. 模块7的DH结构域虽含保守活性位点，但其失活状态与lavencidin结构中C7-C8单键形成相符；
4. 仅模块11含功能性烯酰还原酶（ER₁₁），负责C7-C8双键还原。

P450介导的后修饰机制
研究推测细胞色素P450（LadB1）及其辅因子（LadB2/B3）可能催化C-14甲基的氧化，形成lavencidin特征性羧酸侧链，类似rosamicin生物合成中RosC的催化路径。

技术应用前景
该研究不仅解析了lavencidin的生物合成蓝图，更展示了Target-AID系统在链霉菌中的多重优势：

1. 无需DNA双链断裂即可实现精准编辑；
2. 可快速构建终止密码子或氨基酸替换；
3. 适用于沉默基因簇激活和调控基因改造。
   S. lavendulae FRI-5基因组中尚有35个以上次级代谢基因簇待挖掘，此技术将为发现新型抗生素提供强大助力。

方法学创新
实验体系包含多项优化：

1. 采用硫链丝菌素诱导型tipAp控制融合蛋白表达；
2. 密码子优化的UGI_str和LVA_str标签增强编辑效率；
3. 温度敏感型pSG5复制子便于质粒消除。这些设计显著提升了在放线菌中的操作效率。