高效电穿孔转化系统构建推动 Targetron 在野生型埃尔吉芽孢杆菌 219 中的应用

本文围绕埃尔吉芽孢杆菌 219（Paenibacillus elgii 219）展开研究，系统优化电穿孔转化参数，使转化效率提升至 1.25×106 转化子 /μg DNA ，并首次建立适用于该菌的基于 II 型内含子的基因编辑系统，为芽孢杆菌属的基因工程改造提供了有效方法。

　　

引言

芽孢杆菌属（Paenibacillus）细菌能产生多种生物活性肽和功能性胞外多糖（EPS），具有作为细胞工厂的巨大潜力。埃尔吉芽孢杆菌 219（P. elgii 219）可产生多种抗菌化合物，但该菌产生的粘性 EPS 会导致细胞黏附，限制其生长和生产能力提升。通过基因敲除分析单个糖基转移酶功能，是深入了解 EPS 生物合成途径的有效策略，因此建立高效的基因编辑工具和 DNA 转化方法至关重要。

电穿孔是将外源 DNA 导入宿主细胞的常用方法，但应用于野生型菌株时往往面临挑战，需要对转化方案进行系统优化。同时，目前关于芽孢杆菌基因编辑系统的报道有限，基于 II 型内含子系统的 Targetron 基因靶向技术在芽孢杆菌中尚未有成功应用案例。本研究旨在建立P. elgii 219 的高效电穿孔方案，并构建适用于该菌的 Targetron 基因编辑系统。

材料与方法

1. 细菌菌株、质粒、引物和生长条件：实验使用P. elgii 219、大肠杆菌（E. coli）MC1061 等菌株，以及 pWAe、pUC57、pDX4383 等质粒。P. elgii 219 在营养肉汤（NB）中 37°C 培养，E. coli在 LB 肉汤中培养，必要时添加抗生素。
2. 初始转化方案：培养P. elgii 219 获得电感受态细胞，与质粒混合后进行电穿孔，电击后稀释并在含红霉素的 NB 琼脂平板上培养，计算转化效率。
3. 方案优化
   • 生长培养基优化：将P. elgii 219 在 NB、LB、脑心浸液（BHI）、King’s 肉汤（KB）、Muller–Hinton 肉汤（MH）中培养，筛选合适的生长培养基。
   • 细胞收集阶段：测量P. elgii 219 在 KB 培养基中的生长曲线，在不同光密度（OD₆₀₀）值时收集细胞制备电感受态细胞，研究细胞收集阶段对转化效率的影响。
   • 电场优化：设置不同的电场强度（9 - 24 kV cm^?1），探索电穿孔的最佳电场强度。
   • 洗涤液优化：使用不同的电穿孔缓冲液制备电感受态细胞，评估缓冲液对转化效率的影响。
   • 恢复培养基优化和恢复时间：测试 NB、LB、KB 等多种培养基作为恢复培养基的效果，并设置 1 小时、3 小时和 16 小时的恢复时间，研究恢复条件对细胞恢复和质粒转化的影响。
   • DNA 优化：将不同量的质粒 pWAe 与感受态细胞混合进行电穿孔，确定优化的 DNA 含量。
   • 细胞壁弱化：选择甘氨酸、DL - 苏氨酸等作为细胞壁弱化剂，添加到培养基中处理细胞后制备电感受态细胞，研究细胞壁弱化对转化效率的影响。
   
   
4. 质粒构建和基因组编辑：对P. elgii 219 基因组进行注释，确定参与 EPS 生物合成的基因。构建 pDX4383 质粒，用于敲除gene_4383基因。
5. 统计分析：使用双尾 Student’s t检验进行单因素比较，方差分析（ANOVA）和 Tukey 检验进行多因素比较，P < 0.05 为差异具有统计学意义，使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析和绘图。

结果

1. 培养基优化：KB 培养基最适合P. elgii 219 生长，以此培养基制备电感受态细胞时，转化效率显著提高，可达 1.27×10³ 转化子 /μg DNA。
2. 细胞收集阶段对转化效率的影响：P. elgii 219 在 OD₆₀₀ = 0.5（对数生长早期）时收集制备的电感受态细胞，转化效率最高，可达 2.59×10⁴ 转化子 /μg DNA。4%（vol/vol）接种量的细胞转化效率更高。
3. 电穿孔脉冲电场强度：电场强度为 15 kV/cm^?1时，转化效率最高，达到 6.02×10⁴ 转化子 /μg DNA ，电压过高或过低都会导致转化效率下降。
4. 电穿孔缓冲液：SM 溶液（10% 蔗糖 + 1 mM MgCl₂）作为电穿孔缓冲液时转化效率最佳。添加甘油可延长电感受态细胞的转化能力，但冷冻时间延长会使其转化能力下降。
5. 优化恢复培养基和时间：KB 培养基作为恢复培养基时效果最佳，转化效率达到 1.25×10⁵ 转化子 /μg DNA。恢复时间为 3 小时时，获得的转化子数量最多。
6. 优化 DNA 数量和质量：添加 250 ng 质粒时，转化效率提高到 2.13×10⁵ 转化子 /μg DNA 。添加 750 ng 质粒时，获得的转化子数量最多。
7. 细胞壁弱化：甘氨酸、氨苄青霉素等细胞壁弱化剂可提高转化效率，其中 6% 甘氨酸效果最佳，转化效率可达 1.25×10⁶ 转化子 /μg DNA。但 Tween 80 会降低转化效率，组合使用细胞壁弱化剂未进一步提高转化效率。
8. 方案应用：糖基转移酶失活：优化后的方案使转化效率提高到 1.25×10⁶ 转化子 /μg DNA 。使用 pDX4383 质粒成功敲除gene_4383基因，突变株发酵时无黏附现象。
9. EPS 消除提高电穿孔效率：敲除 EPS 的突变株P. elgii 219 Δ4383 在初始和优化方案下，转化效率均高于野生型菌株，且生长速率更快，OD₆₀₀值更高。

讨论

本研究显著提高了P. elgii 219 电感受态细胞转化外源质粒 DNA 的能力，建立了基于 II 型内含子的基因靶向系统，成功消除了 EPS 的产生。培养基成分、生长阶段、电压等多种因素会影响细胞的转化能力。营养丰富的 KB 培养基有利于P. elgii 219 生长和提高转化效率；对数生长早期的细胞转化效率最高；接种量会影响 EPS 产生，进而影响转化效率；细胞壁弱化剂可提高转化效率，但组合使用可能因细胞毒性而无增效作用；合适的电场强度和电穿孔缓冲液对提高转化效率至关重要；KB 培养基是理想的恢复培养基，3 小时的恢复时间可获得较多转化子。此外，质粒 DNA 的量也会影响转化效率。

结论

本研究系统优化了野生型P. elgii 219 的电穿孔转化效率，达到 1.25×10⁶ 转化子 /μg DNA 。利用优化的电穿孔方案，成功将基因编辑质粒 pDX4383 导入P. elgii 219，并敲除了糖基转移酶基因gene_4383，实现了无细菌黏附的发酵。该研究为芽孢杆菌属的基因工程改造提供了有效的方法。