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本文研究了溢油处理剂（STAs）中的表面清洗剂和化学集油剂对石油生物降解的影响。通过实验发现，STAs 可被微生物降解，还会改变微生物群落结构，虽会减缓某些烃类的降解，但因其易降解，不太可能对海洋环境中石油的好氧生物降解产生负面影响。
一、引言
在海洋环境中，生物降解是影响溢油命运的重要自然过程。微生物常将石油烃作为代谢碳源，这是因为它们频繁接触到人为输入（如石油泄漏、河流径流和工业活动）以及自然发生的油渗漏。同时，温度、营养物质和氧气（或其他末端电子受体）的可用性、石油类型和风化程度等，都对石油生物降解的速率和程度起着决定性作用。
在石油泄漏事件发生时，溢油处理剂（STAs）为应急人员提供了除机械回收和原位燃烧之外的其他缓解策略，以处理漂浮和沉没的石油。在美国，可被授权使用的 STAs 被列在《国家石油和有害物质污染应急计划（NCP）产品清单》中，并根据预期功能分为化学分散剂、表面清洗剂、表面收集剂（即化学集油剂）、生物修复剂、吸附剂和其他溢油控制剂等子类。不同类型的 STAs 使用规模和频率差异很大，且难以确定。例如，化学分散剂或化学集油剂可能在大型（但罕见）的海上石油泄漏中使用，而表面清洗剂则常用于近岸或岸上对大型及小型、频繁发生的石油泄漏的处理。
自 2010 年 “深水地平线” 石油泄漏事件中大量使用化学分散剂后，分散剂对海洋环境中自然发生的石油生物降解的影响受到了广泛研究和严格审视。然而，其他 STAs 却未得到足够关注，尤其是使用其他 STAs 处理石油后的生物降解性以及这些 STAs 对海洋微生物群落的影响，需要更深入的研究。本研究聚焦于表面清洗剂和化学集油剂这两类 STAs，旨在实验室环境中测试它们对石油生物降解的影响。
二、材料和方法
- 原油和微生物接种物来源：实验使用的阿拉斯加北坡（ANS）原油取自 Onta，并在常温下储存。通过向原油中通入干燥氮气，在 25°C 下人工风化约 45 小时，直至质量损失稳定在 8.7%。用于实验的油降解微生物菌群，分离自美国缅因州的海洋海滩样本。该菌群在每升含 3.4 mL 风化 ANS 的人工海水中进行传代培养和富集。人工海水配方参照 GP2，包含多种盐类物质，调节 pH 至 7.9。培养 4 周后，经离心浓缩、清洗，保存在 25% 甘油中，于 -80°C 储存。实验前，将冷冻保存的微生物菌群解冻、清洗并培养 4 天，作为微生物接种物。
- 实验设计：实验采用玻璃血清瓶构建微宇宙，设置 5 种处理组：ANS、ANS + CytoSol、ANS + ThickSlick、CytoSol 和 ThickSlick。向微宇宙中添加富集的微生物菌群接种物，使其细胞浓度达到 5%（体积 / 体积）。在适用处理组中分别加入 80 μL ANS 和 40 μL STA，使 ANS、CytoSol 和 ThickSlick 的初始名义浓度分别为 450 mg/L、220 mg/L 和 240 mg/L。同时设置了杀死对照组（用叠氮化钠灭菌）、无微生物接种物对照组和仅含微生物接种物的对照组。每个处理组进行三次重复实验，血清瓶密封后置于水平轨道摇床上，在 20°C、150 rpm 条件下黑暗培养 48 天。
- 化学分析
- 使用气相色谱法监测微宇宙瓶顶空中的二氧化碳和氧气含量。通过气密玻璃注射器抽取 100 μL 顶空气体注入气相色谱仪（GC）进行分析，以二氧化碳产量衡量石油烃和 STAs 的生物呼吸和矿化程度，同时监测氧气含量确保实验过程维持有氧条件。
- 利用总有机碳分析仪（TOC - VCPH）结合固体样品燃烧模块（SSM - 5000A），按照 EPA SW - 846 方法 9060A 测定风化 ANS、CytoSol 和 ThickSlick 的总碳（TC）和无机碳（IC），计算总有机碳（TOC）。
- 对于石油烃分析，微宇宙样品经加标、萃取、浓缩后，采用配备质谱选择性检测器（MSD）和自动进样器的 GC（Agilent Technologies 6890N），结合 DB - 5 毛细管柱，依据 EPA 方法 8270D 对目标分析物进行定量分析。同时，使用配备火焰离子化检测器和自动进样器的 GC（Agilent Technologies 7890B），按照 EPA 方法 8015D 测定总石油烃（TPH，ANS 处理组）和总可萃取有机物（TEOM，STA 处理组）的浓度。
- 微生物群落组成分析：在各个采样点，从重复的微宇宙中取 1.8 mL 水样，经离心、速冻后保存于 -80°C。使用 AllPrep Bacterial DNA/RNA/Protein Kit 提取 DNA 和 RNA，用 Qubit 荧光计测定其浓度。以纯化的 RNA 为模板，利用 Invitrogen SuperScript IV First - Strand 合成试剂盒合成互补 DNA（cDNA）。对 DNA 提取物和新合成的 cDNA 进行 Illumina MiSeq 测序，靶向 16S rRNA 基因的 V4 区域。测序数据通过 Mothur 生物信息学管道进行组装和质量过滤，使用 Silva 138.1 参考序列进行分类学注释。利用 R 语言的 Phyloseq 包进行数据分析和绘图，包括生成分类学柱状图、进行非度量多维缩放（NMDS）分析、排列多元方差分析（PERMANOVA）等。此外，通过液滴数字聚合酶链反应（ddPCR）测定微生物生长过程中 16S rRNA 基因的拷贝数，以评估微生物数量变化。
三、结果与讨论
- 呼吸作用和微生物生长：在 48 天的实验中，不同处理组的总二氧化碳产量存在差异。含有 CytoSol 的微宇宙比 ANS 和含有 ThickSlick 的处理组更早产生更多二氧化碳。同时含有 ANS 和 STA 的处理组，因添加了更多外源有机碳，在研究期间产生的二氧化碳最多。所有处理组在培养 2 周后呼吸作用均显著减缓，尤其是仅含 STA 的处理组，表明 STA 中的可用碳被快速消耗。然而，含 ANS 的处理组二氧化碳产量持续增加直至实验结束。通过对 16S rRNA 基因拷贝数的量化分析发现，所有处理组均有微生物生长，其中 ANS 处理组微生物生长受限最明显。含有 ANS 和 STA 混合物的处理组（如 ANS + CytoSol）微生物生长程度，与仅含 STA 的处理组（如 CytoSol）相似，但 ANS + ThickSlick 在第 7 天前的生长比仅含 ThickSlick 的处理组延迟。
综合来看，两种 STA 在实验条件下具有高生物降解性，对微生物生长和呼吸的影响可能大于 ANS。CytoSol 主要由长链脂肪酸甲酯（FAMEs）组成，ThickSlick 由 65% 的失水山梨醇单月桂酸酯（Span 20）和 35% 的 2 - 乙基丁醇构成，这些化合物均易于生物降解。此外，在 ANS + STA 处理组中，存在协同作用，其二氧化碳产量高于单独处理组之和，可能是由于添加 STA 作为次生底物引发了共代谢，促进了原本难降解的石油化合物的生物降解。
2. 石油烃的生物降解：到第 14 天，含 ANS 的处理组中总烷烃和多环芳烃（PAHs）浓度平均分别降低了 90% 和 57%。添加 STA 在实验初期会使烷烃降解出现短暂滞后，但在第 3 - 10 天，ANS + CytoSol 和 ANS + ThickSlick 处理组中烷烃降解速度比 ANS 处理组更快。较高分子量的 n - 烷烃（C30 - C35）在 ANS 和 ANS + ThickSlick 处理组中到第 14 天几乎被消耗殆尽，但在 ANS + CytoSol 处理组中仍有 18% 残留，到实验结束时降至 7%。PAHs 的降解在添加 CytoSol 时未受影响，但在 ANS + ThickSlick 处理组中，PAH 降解在最初 72 小时延迟。这可能是因为 ThickSlick 作为化学集油剂，增加了油膜厚度，减少了油滴表面积，降低了油烃的溶解和生物可利用性。
在实验结束时，尽管所有含油处理组中总可分辨 PAHs 平均仍有 36% 残留，但美国环保署（EPA）的高优先级污染物 PAHs 在 ANS 和 ANS + CytoSol 处理组中第 5 天低于检测限，在 ANS + ThickSlick 处理组中第 7 天低于检测限。不过，需要注意的是，EPA 高优先级污染物 PAHs 仅占初始总 PAH 浓度的 4%，且许多单个分析物起始浓度低于方法报告限。同时，烷基化的 3 - 和 4 - 环 PAHs 在残留可分辨 PAHs 中占主导，平均占难降解 PAHs 的 92%，这些烷基化 PAHs 在原油中浓度较高，在环境中更持久，对水生生物毒性更大。
在总石油烃（TPH）监测中，ANS 处理组在第 14 天 TPH 浓度降低了 42%。而在 STA 单独处理组中，CytoSol 和 ThickSlick 处理组在第 5 天，总可萃取有机物（TEOM）分别被消耗 100% 和 93%。推测两种 STA 通过不同机制延迟石油烃的生物降解，ThickSlick 可能降低油烃生物可利用性，但自身快速降解后释放出 ANS 供微生物利用；而在 ANS + CytoSol 处理组中，CytoSol 中易降解的长链脂肪酸甲酯可能成为微生物优先利用的底物，待其消耗完后，微生物才转向利用原油中的烷烃。
3. 微生物群落组成：随着时间和处理方式的变化，总微生物群落和代谢活跃的微生物群落均偏离了初始接种物的组成。通过 16S rRNA 基因扩增子测序表征总微生物群落，而对 16S rRNA 基因转录本（RNA 转化为 cDNA）测序则代表代谢活跃的微生物群落。微生物群落的转变在实验开始后第 3 天（首个采样时间点）就已开始，且不同处理组间逐渐分化，到第 10 天各处理组的微生物群落基本稳定。RNA 部分比 DNA 部分更不稳定，反映了活跃群落对环境变化和资源可用性的快速响应。
通过多种分析方法表明，各处理组形成了独特且均匀分散的群落簇。处理组间的微生物群落组成和结构存在显著差异，同时代谢活跃的微生物群落与总微生物群落也有显著差异，但它们的分散程度相似。不同处理组的微生物群落变化表现为特定分类群的富集和替代。例如，在总微生物群落中，起始接种物中最丰富的属 Sphingorhabdus 在各处理组中相对丰度均下降，而在代谢活跃群落中，仅含 CytoSol 的处理组中该属显著减少。未分类的 Sphingomonadaceae 家族成员在含 ANS 的处理组中丰富，但在仅含 STA 的处理组中减少，这可能与 STAs 中缺乏 PAHs 有关，因为该家族成员以降解 PAHs 而闻名。
在含 ANS 的处理组中，Rhodobacteraceae 家族未分类成员在总微生物群落和代谢活跃群落中相对丰度分别富集 7 倍和 3 倍。Rhodobacteraceae 是代谢多样的海洋异养菌，常见于石油污染水域。在仅含 STA 的处理组中，Gordonia、Rhodococcus 和 Methylophaga 等属显著富集。Gordonia 和 Rhodococcus 具有多种代谢能力，能够降解多种烃类和其他化合物，可能因 STA 作为较简单的碳底物，使其在仅含 STA 的处理组中具有竞争优势。Methylophaga 在含 CytoSol 的处理组中显著富集，虽其代谢作用未明确，但添加 CytoSol 明显有利于该种群的生长和活动。此外，STAs 还筛选出了 Hoeflea 和 Aurantimonas 等属于 Rhizobiaceae 家族的成员，它们在烃污染环境中具有特定功能。
同时发现，各处理组中总微生物群落（基于 DNA）和代谢活跃微生物群落（基于 RNA）中特定分类群的丰度变化趋势相似，但变化幅度不同。在含 CytoSol 的处理组中，这种差异更为明显，反映了活跃群落对 CytoSol 作为底物的快速响应，导致微生物活性变化最大，这与二氧化碳产量和微生物生长实验结果一致。本研究中使用的微生物菌群在富含营养的石油环境中富集，可能使石油降解微生物更具优势。在自然环境中，当地微生物群落可能未预先接触过原油，STAs 对石油生物降解的影响可能更大。此外，实验条件与实际情况存在差异，如 ThickSlick 在实验中的应用比例与实际环境不同，实际中其对 PAH 降解的影响可能较小。
总体而言，表面清洗剂 CytoSol 和化学集油剂 ThickSlick 会改变微生物群落结构，促进特定微生物群体的富集，这些微生物可能促进化合物完全矿化为二氧化碳。虽然这两种 STA 会减缓某些石油烃类的生物降解，但它们易被代谢多样的石油降解微生物群落分解和消耗，因此不太可能对海洋环境中的好氧石油生物降解产生负面影响。
四、致谢
本研究得到了加拿大多伙伴研究倡议（MPRI）、加拿大渔业和海洋部、美国环境保护署（EPA）研究与发展办公室国家国土安全研究计划的资助。同时感谢 Silver Homa 提供的技术支持和 Scott Keely 在基因组分析方面的技术指导。文中观点仅代表作者个人，不一定代表美国环境保护署的观点或政策。提及商品名或商业产品不构成对其的认可或推荐使用。
