自动化全基因组测序平台：临床微生物实验室菌株分型的革新利器

这篇研究对比了细菌全基因组测序（WGS）的自动化与手动方法。研究表明，自动化的 Clear DxTM WGS 平台与手动方法结果高度一致，且在周转时间、成本和人力上优势显著，为临床微生物实验室菌株分型带来新选择。

　　

引言

医院感染（nosocomial infection）传播严重威胁患者安全，尤其是免疫抑制患者、婴儿、老年人以及使用导管或机械通气的人群。在疑似感染爆发时，确定感染是由单一菌株还是多种无关菌株引起至关重要，这决定了后续防控措施。

全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）近年来成为细菌菌株分型的重要工具，逐渐取代血清分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）等传统方法。WGS 具有高分辨率，能精准区分密切相关菌株，还可预测抗菌药物耐药性、明确耐药机制和识别毒力因子。

随着 WGS 在临床和公共卫生实验室的广泛应用，对其流程改进的需求日益凸显。Clear Dx^TM仪器是一种全自动平台，在 SARS-CoV-2 大流行期间，其用于基因组监测和变异追踪，显著缩短了检测时间。此外，该平台对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分离株的检测，可实现早期识别和耐药性预测。

梅奥诊所（Mayo Clinic）自 2017 年起临床应用 WGS 结合核心基因组多位点序列分型（cgMLST）分析多种细菌分离株的相关性，但传统手动 WGS 流程存在耗时长、人力需求大、成本高等问题。因此，本研究对比 Clear Dx^TM仪器与手动 WGS 流程，评估二者在结果一致性、周转时间、成本和流程简化方面的差异。

材料与方法

1. 细菌分离株：研究选用 226 株细菌分离株，涵盖 18 种细菌，包括金黄色葡萄球菌（72 株）、鲍曼不动杆菌（8 株）等。这些分离株来自明尼苏达州卫生部、抗菌药物耐药性领导小组、梅奥诊所临床和研究实验室以及法国一家医院微生物实验室。
2. 培养方法：不同细菌分离株的培养条件各异。如弯曲杆菌在巧克力琼脂上，42°C 微需氧环境培养 18 - 24 小时；嗜肺军团菌在缓冲炭酵母提取物琼脂上，35 - 37°C 普通环境培养 48 小时等。
3. 手动 WGS 方法：使用 Quick-DNA^TM真菌 / 细菌微量制备试剂盒提取细菌 DNA，用 Quantus^TM荧光计定量并稀释至 0.2 ng/μL。采用 Nextera XT DNA 文库制备试剂盒进行文库制备，在 MiSeq 仪器上用 2×250 bps 循环试剂盒测序，除艰难梭菌目标覆盖率为 200× 外，其他物种均为 100×。
4. 自动化 WGS 方法：革兰氏阴性菌取 1 μL 菌液、革兰氏阳性菌取 4 μL 菌液，在含提取珠的 2 mL 管中用 400 μL 重悬缓冲液重悬，涡旋 30 s 后取 100 μL 上清至 96 孔板。在 Clear Dx^TM平台上，按 “分离株” 样本输入类型和 Clear Dx^TM微生物监测 WGS v2.0 协议进行测序，根据微生物基因组大小和 iSeq100 测序仪容量，将目标覆盖率降至 30 - 80×，实际覆盖率为 48× - 171×，平均 88×。该平台全自动完成细胞裂解、核酸提取、文库制备，并将测序 cartridges 加载到两台 Illumina iSeq100 测序仪上，运行时间 26 - 32 小时，平均 28 小时。需注意，此自动化平台仅用于研究，未获临床诊断批准。
5. 数据分析：用 SeqSphere + 软件 v10.0.5 分析两种 WGS 方法的序列数据。将双端.fastq.gz 文件上传到 SeqSphere+，用 SKESA v2.3.0 进行从头组装。组装后的序列在 SeqSphere + 中通过物种特异性 cgMLST 流程处理，根据等位基因差异构建最小生成树（MSTs）展示菌株关系。依据梅奥诊所临床实践中已验证的物种特异性 cgMLST 等位基因差异阈值，将菌株分为相关、可能相关和不相关三类。通过比较两种方法生成的 MSTs 以及距离矩阵，评估结果一致性。同时计算手动和自动化流程各步骤的周转时间、人工操作时间和成本。

结果

1. 结果一致性：自动化 WGS 方法获得的菌株物种水平鉴定结果与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）鉴定结果完全一致。在 224 株分析的菌株中，222 株（99%）两种方法的相关性分组结果一致，仅两株表皮葡萄球菌（MBRL2787 和 MBRL2788）因一个等位基因差异，在手动方法中为 “可能相关”，在自动化方法中为 “相关”。
2. 相关性分析：通过 Mantel Spearman 相关性分析，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等多种细菌的手动和自动化 WGS 方法相关性系数高于 0.900，P 值 < 0.0001，表明两种方法高度相似。鲍曼不动杆菌、弯曲杆菌属和表皮葡萄球菌的相关性系数较低，但两种方法的最终解释受影响较小。阴沟肠杆菌复合体样本量小（n = 4），P 值不显著，但两种方法相关性最高（r = 1）。
3. 周转时间：Clear Dx^TM平台使周转时间从手动流程的 44 - 47 小时缩短至 26 - 32 小时（平均 28 小时），主要得益于 iSeq 测序仪测序时间从 39 - 42 小时减至 19 小时，且 iSeq 测序流细胞容量小，可更频繁运行，无需像 MiSeq 那样批量处理样本。
4. 成本：成本分析显示，使用 Clear Dx^TM仪器可节省成本。自动化减少了人工成本，降幅达 93%，试剂和耗材成本也因使用 Clear Labs 细菌 WGS 试剂盒而降低 22% - 54%，总体成本节省 34% - 53%（1 - 12 株样本量）。
5. 流程简化：手动 WGS 流程中，样本提取、文库制备和测序在不同地点进行，而 Clear Dx^TM仪器可在同一封闭环境完成整个流程。自动化文库制备减少了人工操作步骤，降低了人员培训需求和移液误差风险，减轻了人体工程学压力。

讨论

WGS 虽比传统细菌菌株分型方法有显著进步，但手动文库制备流程复杂，对技术人员要求高，是临床实验室面临的挑战。部分自动化平台虽能进行文库制备，但仍需人工将文库加载到测序仪。

本研究中，自动化细菌 WGS 检测与手动流程结果高度一致，且在周转时间、人工操作、成本和流程效率方面表现更优。不过，研究存在局限性，样本量较小，部分物种缺乏不同相关性类别的菌株，且无法直接对比手动和自动化方法中 Illumina 测序仪的效果。

随着自动化技术发展，WGS 将更易在临床实验室应用，有助于快速响应感染爆发，深入了解病原体致病性和传播机制。未来研究可将自动化应用于物种鉴定、耐药基因和突变分析等方面。