揭秘铜绿假单胞菌 PAO1 中新型 sRNA——LapS 的调控 “密码” 及其致病关联

本文聚焦铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1，发现新型小非编码 RNA（sRNA）LapS。它源自 lapA 基因相关序列，参与调控群体运动、鼠李糖脂等生成，还调节 las/rhl 群体感应系统及生物膜形成，为深入理解其致病机制提供关键线索。

　　

研究背景

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是常见的医院感染病原菌，能引发多种严重感染，其致病性与多种毒力因子相关，如吩嗪、弹性蛋白酶、鼠李糖脂等 。同时，该菌易形成生物膜，导致慢性伤口感染、囊性纤维化等疾病。

细菌毒力受群体感应（quorum-sensing，QS）系统和环境应激的调控网络影响。铜绿假单胞菌拥有至少三种 QS 系统，即 las、rhl 和 pqs 系统，这些系统控制着 300 多个与毒力因子产生和生物膜形成相关的基因表达。环境应激，如磷酸盐缺乏，也能促进毒力因子的产生。

近年来研究发现，小非编码 RNA（sRNA）参与细菌的发病机制，包括 QS 和毒力调控。虽然通过转录组测序在铜绿假单胞菌中鉴定出了一些潜在的 sRNA，但对这些新型 sRNA 的功能研究较少。本研究旨在探究铜绿假单胞菌中一种新型 sRNA 对毒力产生和生物膜形成的调控作用。

研究结果

1. 鉴定 PAO1 生物膜中 sRNA 候选物：通过对之前 RNA 测序（RNA-seq）数据的分析，发现编码碱性磷酸酶的 lapA 基因在铜绿假单胞菌 PAO1 于慢性伤口模型中形成生物膜时高度表达。进一步分析 RNA-seq 数据，预测出 434 个 sRNA，其中 102 个在生物膜中差异表达，67 个表达上调。在这些差异表达的 sRNA 中，sRNA0078（后命名为 LapS）在成熟生物膜中上调最为显著，且其表达在整个生物膜发育周期均高于浮游状态，该 sRNA 位于 lapA 基因的 5′ 非翻译区（5′ UTR）。
2. LapS 的来源鉴定：Northern blotting 分析显示，LapS 在磷酸盐缺乏的培养基中高度表达，在磷酸盐丰富的培养基中表达较低。通过 5′ 和 3′ 快速扩增 cDNA 末端（RACE）实验确定，LapS 转录起始位点（TSS）与 lapA 基因的 TSS 相同，对应于 lapA 的 - 107 位置，转录终止位点（TTS）对应于 lapA 的 + 90 位置，LapS 长度为 197 个核苷酸，它来源于 lapA 基因的 5′ UTR 和内部序列。
3. LapS 对 lapA mRNA 水平的调控：构建 LapS 突变株和过表达株，在磷酸盐缺乏条件下培养，测量碱性磷酸酶活性和 lapA 基因的表达水平。结果显示，LapS 突变株的碱性磷酸酶活性高于野生型菌株，LapS 过表达株的碱性磷酸酶活性显著降低。qRT-PCR 结果表明，LapS 突变株中 lapA 基因的表达上调，过表达株中 lapA 基因的表达略有下调，说明 LapS 在磷酸盐缺乏条件下抑制 lapA 基因的表达，从而减少碱性磷酸酶的产生。
4. LapS 对鼠李糖脂产生的调控：先前研究表明 lapA 基因缺失会增加鼠李糖脂的产生，而 LapS 突变会增加 lapA 基因的表达。通过群体运动实验、游泳实验、亚甲基蓝络合实验和 qRT-PCR 检测相关基因表达，结果显示 LapS 突变显著降低了群体运动能力和鼠李糖脂的产生，LapS 过表达则增加了群体运动能力和鼠李糖脂的产生，表明 LapS 在磷酸盐缺乏条件下正调控鼠李糖脂的产生。
5. LapS 对 las/rhl 系统的影响：研究发现 LapS 缺失会增加 AHL 信号分子的产生，通过 AHL 报告平板生物测定、qRT-PCR 检测 QS 相关基因表达和高效液相色谱（HPLC）检测 AHL 信号分子，结果显示 LapS 缺失增加了 C4 - HSL 和 3 - 氧代 - C12 - HSL 的产生，干扰了 rhlR 基因的表达，显著增加了 lasI 基因的表达，表明 LapS 通过调节 lapA 基因水平影响 AHL 信号产生。
6. LapS 对生物膜形成的影响：在慢性伤口模型中评估 ΔLapS 菌株的生物膜形成能力，结果显示 LapS 缺失诱导了 PAO1 在慢性伤口模型中的生物膜形成。通过 qRT-PCR 检测 lapA 基因和 QS、胞外多糖（EPS）相关基因的表达，发现 LapS 缺失增加了 lapA 基因和 QS 相关基因的表达，表明 LapS 缺失通过增加 lapA 基因水平提高 QS 活性，从而诱导生物膜形成。
7. LapS 对铜绿假单胞菌毒力的影响：在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）快速致死实验中，ΔLapS 菌株的毒力显著降低，秀丽隐杆线虫感染 ΔLapS 菌株 30 小时后的存活率明显高于感染野生型菌株；但在慢速致死实验中，LapS 缺失对秀丽隐杆线虫的存活率没有影响，表明 sRNA LapS 在铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫的急性感染中发挥作用。
8. LapS 对 putA 基因的直接调控：利用 IntaRNA 数据库预测 LapS 的靶基因，发现 putA 基因的一个 16 核苷酸区域与 LapS 具有广泛的碱基配对互补性。通过构建绿色荧光蛋白（GFP）报告系统，结果显示 LapS 能直接靶向 putA 基因，抑制其表达。

研究讨论

本研究重新分析 RNA-seq 数据，鉴定出许多与铜绿假单胞菌慢性伤口生物膜相关的潜在 sRNA，其中 LapS 是位于 lapA 基因 5′ UTR 的新型 sRNA。LapS 的调控作用与其他源自 5′ UTR 的 sRNA 不同，它负调控 lapA mRNA 的水平，防止 LapA 在磷酸盐缺乏条件下过度产生，这种 LapS - lapA 信号级联有助于平衡铜绿假单胞菌的毒力调控。

LapS 参与调控铜绿假单胞菌的多种毒力表型，如鼠李糖脂产生、群体运动等，还直接靶向毒力因子 putA 基因，影响细菌的急性感染过程。此外，LapS 缺失对生物膜形成的影响可能与降低群体运动能力有关。本研究揭示了一种未被研究的调控 sRNA，突出了 sRNA 在铜绿假单胞菌 PAO1 发病机制中的重要性。

研究方法

1. 细菌菌株、质粒和生长条件：列出研究中使用的细菌菌株和质粒，说明培养条件和使用的抗生素。
2. RNA-seq 数据分析：使用 Rockhopper 软件进行 sRNA 的比对和预测，通过 RSEM 计算 sRNA 的表达，用 DESeq2 进行差异表达分析，用 IntaRNA 预测 sRNA 的靶基因。
3. Northern blotting 和 RACE 实验：在不同条件下培养铜绿假单胞菌 PAO1，提取 RNA 进行质量检测后，用于 Northern blotting 和 RACE 实验，具体描述了实验操作步骤。
4. 构建 LapS 缺陷和互补菌株：通过双交换同源重组构建 LapS 缺陷株，用 pBBR1MCS - 5 载体构建互补菌株。
5. 构建 sRNA LapS 过表达菌株：以 pUCP18 为载体构建 LapS 过表达菌株。
6. 碱性磷酸酶活性测定：培养细菌后，检测培养物的吸光度，收集上清液检测碱性磷酸酶活性，实验重复至少三次。
7. 运动性测定：通过游泳和群体运动实验测定细菌的运动性。
8. 鼠李糖脂测定：采用亚甲基蓝络合方法测定鼠李糖脂的产生。
9. AHL 检测实验：利用Chromobacterium violaceum CV026 作为生物传感器可视化 AHLs，用 HPLC 提取和测量 AHL 信号分子。
10. 生物膜形成测定：在猪皮肤外植体上进行生物膜形成实验，描述了实验操作步骤和检测方法。
11. qRT-PCR 测定：提取 RNA 合成 cDNA，设计引物进行 qRT-PCR 实验，以特定基因作为内参，计算基因表达的倍数变化。
12. 秀丽隐杆线虫快速致死和慢速致死实验：分别进行快速致死和慢速致死实验，观察线虫的存活情况。
13. 荧光报告实验：构建相关质粒，转化大肠杆菌，培养后检测荧光强度。
14. 统计分析：实验至少重复三次，采用单因素方差分析和 Student’s t 检验确定差异显著性，用 log-rank Mantel-Cox 检验比较线虫存活率。