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本文对 255 株来自中国不同葡萄酒产区的酒酒球菌（Oenococcus oeni）进行基因组测序和耐酸表型分析。通过比较基因组学，揭示了菌株多样性、耐酸表型与基因组岛、特定基因的关联，为筛选和改良耐酸菌株、提升葡萄酒品质提供了重要依据。
引言
苹果酸乳酸发酵（MLF）是酿酒尤其是红葡萄酒酿造中的关键环节。在这个过程中，乳酸菌（LAB）将口感尖锐的苹果酸转化为较为温和的乳酸，降低葡萄酒的酸度，提升风味、香气以及微生物稳定性。然而，LAB 在适应酿酒的严苛环境时面临诸多挑战，比如高酸度、高乙醇含量、低温、高二氧化硫（SO?）水平和营养匮乏等，其中酸性应激会显著抑制 LAB 的生长，阻碍发酵进程。因此，筛选具有强耐酸性的 LAB 菌株对确保 MLF 的稳定和高效至关重要。
酒酒球菌是 MLF 中最常用的菌株，因其对葡萄酒环境压力有出色的适应性。不过，当葡萄酒酸度太高时，酒酒球菌的生长也会受到抑制。所以，选择耐酸性更强的酒酒球菌菌株对保证 MLF 顺利进行意义重大，不仅能提高发酵效率、降低成本、减少微生物污染风险，还能提升葡萄酒的整体品质。
与其他 LAB 不同，酒酒球菌缺乏合适的分子生物学技术进行基因改造，这使得研究其基因功能和调控机制颇具难度。虽然已有诸如电穿孔和反义 RNA 等方法用于酒酒球菌的分子水平研究，但这些方法存在重复性差等问题。而异源表达虽在一定程度上解决了部分难题，但仍面临基因表达水平低、因细胞环境和代谢途径差异导致结果不准确等挑战。相比之下，基因组学为研究酒酒球菌的应激反应机制提供了有效途径，能显著提高研究效率，有助于发现潜在的基因型 - 表型关联，为后续基因验证奠定基础。
微生物可通过水平基因转移（HGT）适应压力环境，形成包含多个辅助基因的泛基因组。对酒酒球菌泛基因组进行比较基因组学分析，能揭示菌株间的进化关系，阐明与表型相关的菌株多样性。目前，比较基因组学常与全基因组关联研究（GWAS）相结合，更全面地阐释基因型与表型之间的关系。GWAS 已被广泛用于研究细菌致病性、抗生素抗性等多种性状的统计学关联。
本研究对 255 株酒酒球菌进行测序、组装和注释，开展大规模比较基因组分析，并评估这些菌株在酸性应激环境中的抗性。通过整合比较基因组学和 GWAS，明确酒酒球菌菌株间的进化关系，探究耐酸性的基因型 - 表型关联。研究旨在分析分离源、菌株多样性和基因组岛之间的关系，识别与耐酸性相关的基因，为耐酸酒酒球菌在酿酒行业的潜在应用提供理论基础。
结果
基因组和泛基因组特征
为全面了解酒酒球菌的菌株多样性，研究选取了 1999 年至 2016 年间来自中国不同地区的 255 株酒酒球菌，其中 7 株基因组数据从 NCBI 数据库下载，其余 248 株在本研究中进行测序和组装。这 255 株菌株的平均基因组大小为 2.1 Mb，平均 GC 含量为 37.88%，平均 N50 为 1.12 Mb，平均深度为 912×，各项数据均在合理范围内，且 GC 含量存在显著的地区差异。
对 255 株酒酒球菌进行泛基因组分析后，共鉴定出 16,416 个泛基因。其中，核心基因组包含 1,028 个基因，包括 840 个核心基因和 188 个软核心基因。泛基因组拟合曲线呈上升趋势，根据 Heaps' 定律，指数 γ = 0.37，表明酒酒球菌的泛基因组是开放的；核心基因组累积曲线的指数接近 0，说明核心基因组处于稳定状态。在 COG 数据库注释的 10,906 个泛基因中，除未知功能基因外，大部分基因涉及代谢、细胞过程与信号传导以及信息处理与存储。
菌株多样性分析
平均核苷酸同一性（ANI）常用于确定物种界限，ANI 值超过 95% 通常表明生物属于同一物种。本研究以 PSU - 1 菌株为参考，与所有分离株比较，ANI 值在 98.88% - 99.85% 之间，确认这些分离株均属于酒酒球菌。
Lorentzen 等人曾基于核心基因组系统发育树将酒酒球菌分为四个系统发育群（A、B、C 和 D）。本研究随机选取了代表四个系统发育群的 45 株菌株，与 255 株分离株共同构建系统发育树，结果显示这些分离株属于 A 和 B 两个系统发育群，并进一步细分为 A1、A2、B1 和 B2 四个亚群。
多位点序列分型（MLST）是分析菌株多样性的常用方法，本研究通过 MLST 在 255 株分离株中鉴定出 53 种不同的序列类型（STs）。不过，MLST 仅基于七个管家基因，可能无法准确解析复杂的菌株多样性。相比之下，PopPUNK 方法基于全基因组变异进行分析，分辨率更高。本研究中 PopPUNK 分析产生了 91 个进化枝，其中 1 和 2 号进化枝包含的分离株数量最多，占总数的 36.1%。
酸性应激对酒酒球菌存活的影响及耐酸表型分类
实验设置 pH 3.4 的实验组模拟酸性环境，以 pH 4.8（酒酒球菌生长的最适 pH）的对照组进行对比。在 26°C 孵育 7 天后进行菌落计数，发现实验组菌落数（2.2×10? CFU/mL）显著低于对照组（6.5×10? CFU/mL）。根据存活率是否高于中位数（10.5%），将分离株分为耐酸和敏感两类，耐酸分离株的存活率和 GC 含量均显著更高。
菌株多样性与耐酸表型的相关性分析
通过卡方检验分析菌株多样性与耐酸表型的相关性，发现 B1 和 B2 系统发育群与耐酸表型呈显著正相关，A2 系统发育群则呈显著负相关。
从 MLST 分析鉴定的 53 个 STs 中选取 8 个主要 STs（每个包含超过 10 个分离株）进一步研究，发现 4 个 STs（ST5、ST6、ST17 和 ST25）与耐酸表型显著相关，其中只有 ST25 呈正相关，其余三个呈负相关，且 ST25 属于 B1 系统发育群。
在 PopPUNK 分析鉴定的 91 个进化枝中选取 6 个主要进化枝（每个包含超过 10 个分离株）研究，发现 2、3、5 和 6 号进化枝与耐酸表型显著相关，5 和 6 号进化枝呈正相关，2 和 3 号进化枝呈负相关，5 和 6 号进化枝分别属于 B1 和 B2 系统发育群。综合来看，耐酸的酒酒球菌分离株与菌株多样性相关，主要与 MLST 分析中的 ST25 以及 PopPUNK 分析中的 5 和 6 号进化枝有关，这些菌株多样性均属于 B1 和 B2 系统发育群，因此选择 B1 和 B2 系统发育群的分离株更有可能获得耐酸菌株。
分离区域、基因组岛与表型的相关性分析
基因组岛是富含特定功能基因的基因组区域，可能与表型特征密切相关。利用 IslandViewer 4 和 IslandCompare 软件对分离株的基因组岛进行鉴定、相似性计算和聚类分析，命名了 10 个主要基因组岛（每个包含超过 15 个分离株）。其中 6 个与耐酸表型显著相关，包括 ISL1、ISL3、ISL5、ISL6、ISL7 和 ISL9，ISL3、ISL6 和 ISL7 呈正相关，ISL1、ISL5 和 ISL9 呈负相关。
PHASTER 分析显示，ISL3、ISL6 和 ISL7 编码原噬菌体基因，BLAST 序列比对证实它们与噬菌体 phiS11 有高度同源性，而与耐酸表型负相关的 ISL1、ISL5 和 ISL9 未与噬菌体序列比对上。共线性分析表明，原噬菌体基因组岛含有更多同源基因，非原噬菌体基因组岛同源基因较少，且两者之间未发现同源基因。
分析分离区域发现，来自陕西和山东的分离株与耐酸表型呈显著正相关。山东的所有分离株均属于 B1 系统发育群，陕西的大部分分离株（64%）属于 B2 系统发育群，说明从这两个地区筛选酒酒球菌菌株更易获得耐酸菌株。
全基因组关联研究确定与耐酸相关的基因
为阐明酒酒球菌适应酸应激的遗传基础，对 A 和 B 两个系统发育群分别进行 GWAS。在 A 系统发育群中发现 218 个与耐酸表型显著相关的候选基因，分为 18 个功能类别，主要涉及细胞壁 / 膜 / 包膜生物合成、氨基酸转运和代谢以及碳水化合物转运和代谢。在 B 系统发育群中鉴定出 43 个候选基因，分布在 16 个功能类别中，主要与碳水化合物转运和代谢、细胞壁 / 膜 / 包膜生物合成以及复制、重组和修复相关。
对 A 和 B 系统发育群的基因进行通路富集分析，发现这些基因主要参与氨基酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及糖酵解 / 糖异生途径。四个候选基因（betI、higA、Int - Tn和group_1499）在两个系统发育群中均显著存在，betI和higA是转录调节因子，Int - Tn是噬菌体整合酶，group_1499编码核酸酶，它们参与复制、重组和修复以及转录过程。
讨论
菌株多样性与耐酸表型的相关性分析表明，B1 和 B2 系统发育群与耐酸表型显著相关，这些分离株主要来自山东和陕西，且大多含有与噬菌体相关的基因组岛。GWAS 进一步确定与耐酸表型相关的基因主要参与碳水化合物和氨基酸代谢，并鉴定出四个与耐酸表型相关的基因。
不同地区分离株的耐酸性存在差异，河北的分离株主要为酸敏感型，而山东和陕西的分离株多为耐酸型。这可能与葡萄成熟过程中的环境因素有关，温度、光照和农业实践等都会影响葡萄的成熟度和酸度。山东和河北气候相似，但由于全球变暖，葡萄成熟加速，2016 年河北葡萄的酸度低于 1999 年的山东葡萄。陕西秋季湿度大，葡萄成熟期间降雨多，影响光照和葡萄成熟，为减少损失常提前采收，导致葡萄酒酸度较高，因此从山东和陕西葡萄酒中筛选出的酒酒球菌分离株耐酸性较强。
水平基因转移（HGT）是细菌进化的重要驱动力，通过转化、转导和结合三种机制使细菌获得新的遗传物质。HGT 可形成基因组岛，其中包含与耐酸、抗抗生素和耐盐等相关的基因。本研究发现与耐酸相关的基因组岛与原噬菌体基因有关，表明噬菌体相关的外源基因在酒酒球菌的耐酸性中可能起关键作用。
基因富集分析显示，与耐酸表型显著相关的通路主要涉及碳水化合物和氨基酸代谢。细菌抵抗酸应激需要能量，这些代谢过程能提供能量，增强细菌的耐酸能力。研究鉴定出的四个基因中，betI基因作为转录调节因子，与应激抗性有关，可能通过调节细胞内胆碱和甘氨酸甜菜碱水平中和 H?离子，维持膜稳定性，从而有助于耐酸；higA基因虽也为转录调节因子，但在耐酸方面的作用还需进一步研究；Int - Tn基因编码的噬菌体整合酶参与转导，促进原噬菌体基因整合到酒酒球菌基因组中，有助于适应酸应激；group_1499基因编码的核酸内切酶参与 DNA 修复，可修复酸诱导的遗传损伤，对耐酸有一定贡献。
本研究通过分析菌株多样性，建立了酒酒球菌遗传背景与耐酸表型之间的联系，为耐酸菌株的筛选和鉴定提供了理论基础，确定了与耐酸相关的关键通路和基因，有助于深入理解耐酸机制。未来可利用组学或基因编辑方法进一步深入探究酒酒球菌的耐酸机制。
材料和方法
基因组 DNA 提取
本研究使用了 255 株酒酒球菌分离株，其中 7 株基因组数据来自 NCBI 数据库，对其余 248 株采用 OMEGA Bio - Tek Co. 的 D3350 细菌 DNA 试剂盒提取基因组 DNA，并通过 1% 琼脂糖凝胶电泳评估 DNA 质量。
全基因组测序和组装
对 248 株分离株采用 Illumina PE150 高通量测序技术进行全基因组测序，生成 150 bp 的双端读长，约 2 Gb 的原始数据。利用 Trimmomatic v0.39 进行降噪和去除接头，使用 FastQC v0.11.9 进行质量控制，MultiQC v1.11 整合结果。用 SPAdes v3.15.4 进行组装（启用 “--careful” 参数），以 PSU - 1 菌株的完整基因组为参考基因组，通过 QUAST v5.0.2 评估序列长度、N50 和 GC 含量。
生长条件和表型测试
将分离株在 pH 4.8 的液体培养基中培养至 OD???达到 0.8，然后接种到不同 pH 值（pH 3.4 的实验组和 pH 4.8 的对照组）的液体培养基中，在 26°C 孵育 120 h。孵育后在 pH 4.8 的琼脂平板上进行菌落计数，计算存活率并根据中位数存活率对分离株进行耐酸和敏感分类。
菌株多样性和泛基因组分析
使用 FastANI v1.33 评估菌株间的 ANI，PopPUNK v2.6.3 基于可变长度 k - mers 分析菌株多样性，MLST 采用 mlst v2.23.0 按照 Bridier 提出的分型方案进行。利用 IslandViewer 4 和 IslandCompare 分析和比较基因组岛，Clinker v0.0.31 进行基因组岛的共线性分析。用 Prokka v1.12 进行基因组注释，Roary v3.13.0 进行泛基因组分析，FastTree v2.1.11 生成系统发育树。
相关性分析
使用 IBM SPSS Statistics 23 进行相关性分析，通过卡方检验和 OR 分析研究不同菌株多样性与表型之间的关系，以 P 值判断结果的统计学意义，OR 值量化变量间关联的强度和方向。
全基因组关联研究（GWASs）
利用可变长度 k - mers 和基因存在 / 缺失（GPA）数据，采用线性混合模型（LMM）和固定效应模型进行 GWAS，以确定与酒酒球菌耐酸相关的基因。用 FSM - lite 将组装的基因组片段化为 9 - 100 bp 的 k - mers，Roary v3.13.0 生成 GPA 数据，Pyseer v1.3.10 分析基因与表型的关联，Bwa 中的 fastmap 算法将 k - mers 映射到 PSU - 1 基因组，eggNOG - mapper v2.1.4 进行基因功能注释。
致谢
本研究得到陕西省重点研发计划（2024NC2 - GJHX - 10）、宁夏回族自治区重点研发计划（2023BCF01027 和 2022BBF2015）、山东省重大科技创新工程（2022CXGC010605）和国家自然科学基金（32072206）的支持。
