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这篇研究聚焦人类内脏利什曼病（HVL），目前尚无有效疫苗。研究人员发现新型蛋白 LinKAP，经实验验证，其重组形式（rLinKAP）联合佐剂在小鼠和仓鼠模型中，作为预防性和治疗性疫苗均展现出良好效果，为利什曼病疫苗研发带来新突破。
研究背景
人类利什曼病（HL）是一类与贫困地区密切相关的寄生虫病，全球超 10 亿人受威胁。其中，内脏利什曼病（VL）最为严重，由利什曼原虫（Leishmania）的某些物种引起，若不治疗，死亡率高达 95%，每年有 5 - 9 万新发病例 。当前，VL 的治疗和控制依赖化疗与诊断，但免疫反应复杂、寄生虫变异及宿主与寄生虫的相互作用影响了这些方法的效果。多数 VL 患者康复后会产生长期保护性免疫，暗示了有效预防策略的可能性。不过，目前仍缺乏人类 VL 疫苗，而治疗性疫苗具有很大潜力。有效 VL 疫苗应激发强烈持久的 Th1 细胞免疫反应，其中干扰素 γ（IFN-γ）能激活巨噬细胞清除寄生虫，Th2 反应则会促进疾病进展，因此平衡 IFN-γ 和白细胞介素 - 10（IL-10）的产生至关重要。重组蛋白疫苗因稳定性高、成本效益好等优势被广泛研究，免疫蛋白质组学也成为发现新抗原的有效策略。
LinKAP 蛋白的特征
LinKAP 蛋白由利什曼原虫婴儿亚种（Leishmania infantum）染色体 27 上的单拷贝基因编码，最初被注释为动基体相关蛋白样蛋白，理论分子量 72kDa 。该基因仅存在于锥虫目寄生虫中，包括利什曼原虫属（Leishmania）、锥虫属（Trypanosoma）和内锥虫属（Endotrypanum）。LinKAP 含有约 60% 的重复氨基酸单元，在这些属中高度保守。通过系统发育树分析发现，利什曼原虫属和锥虫属的 LinKAP 序列形成不同分支，且利什曼原虫属内的序列进化保守性高。LinKAP 蛋白包含与线粒体运动相关的毛透明蛋白 - 网蛋白同源（TPH）结构域和与细菌摄取大肠杆菌素及丝状 DNA 有关的 TolA 结构域，这两个结构域在 LinKAP 蛋白中覆盖范围均约为 32.73% ，显示出高度保守性。Western blot 分析表明，LinKAP 在不同利什曼原虫物种的前鞭毛体阶段均有表达，但部分物种的蛋白分子量与预测值存在差异，可能是由于序列数据质量问题、重复序列重排或潜在的糖基化修饰。免疫荧光实验证实，LinKAP 在利什曼原虫墨西哥亚种（Leishmania mexicana）感染的巨噬细胞内的无鞭毛体阶段也有表达。
LinKAP 蛋白的亚细胞定位
通过对利什曼原虫墨西哥亚种细胞器进行氮空化处理和差速离心，研究发现 LinKAP 在低速沉淀组分中富集，该组分对应线粒体，与线粒体标记物 HMGCS 的分布模式相似。利用 Cas9 介导的基因组工程技术，在 LinKAP 基因的 N 端或 C 端标记 3×Myc 融合 mNeonGreen（mNG），构建细胞系。经流式细胞术和活细胞荧光成像分析，结果显示 LinKAP 主要位于线粒体区域，且不与动基体特异性共定位，在利什曼原虫婴儿亚种和亚马逊亚种（Leishmania amazonensis）中也得到了类似的结果，表明 LinKAP 是一种线粒体相关蛋白。
重组 LinKAP 作为疫苗候选物的研究
基于抗原表位预测，设计了包含 LinKAP 部分序列的重组蛋白（rLinKAP）作为 VL 疫苗候选抗原。rLinKAP 包含 N 端 54 个氨基酸，含有 B 细胞和 T 细胞抗原表位，以及 15 个 10 氨基酸的重复序列，预测分子量约 23kDa ，等电点 4.77 。在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并纯化 rLinKAP，聚丙烯酰胺凝胶和免疫印迹分析证实其表达和纯化成功，MALDI - TOF 质谱分析确认其分子量与理论值相符，且内毒素污染水平低，适合用于免疫实验。对 rLinKAP 进行二级结构分析，发现其主要为灵活无序的 “其他” 结构（41.43%±0.45%），其次是 α - 螺旋（25.73%±0.65%）、反平行 β - 折叠（12.83%±0.82%）、转角（11.80%±0.14%）和平行 β - 折叠（8.20%±0.54%） 。ELISpot 实验表明，rLinKAP 能显著增加 IFN-γ 分泌细胞数量，引发强烈的 T 细胞反应，显示出作为 VL 疫苗候选物的潜力。
动物接种 rLinKAP 后的免疫保护反应
为评估 rLinKAP 的免疫原性和保护潜力，用 rLinKAP 联合 Poly ICLC（一种含羧甲基纤维素和聚赖氨酸稳定剂的合成佐剂）对小鼠和仓鼠进行免疫实验。小鼠接受三次皮下注射，间隔 21 天。免疫 30 天后检测发现，rLinKAP + Poly ICLC 免疫组小鼠产生了强烈的抗 rLinKAP 抗体反应，尤其是 IgG2a 水平显著升高。刺激免疫小鼠的脾细胞 48 小时后，检测到 IFN-γ 产量显著增加，而 IL-10 水平较低，细胞因子产生谱显示为 Th1 型免疫反应。感染利什曼原虫婴儿亚种后，免疫组小鼠肝脏和脾脏中的寄生虫负荷显著降低。在仓鼠模型中，rLinKAP + Poly ICLC 免疫组仓鼠血清 IgG 水平升高，主要是 IgG2/3，未检测到 IgG1 。感染后，免疫组仓鼠体重稳定且存活，脾脏寄生虫负荷明显低于对照组，这些结果表明 rLinKAP 是一种有前景的抗利什曼原虫感染疫苗候选物。
rLinKAP 在治疗动物中的免疫治疗效果
评估 rLinKAP + Poly ICLC 对感染利什曼原虫婴儿亚种的 BALB/c 小鼠的免疫治疗潜力。感染 60 天后，小鼠接受与预防性实验相同的疫苗制剂治疗 1 周。治疗 15 天后检测发现，治疗组小鼠抗 rLinKAP 的 IgG、IgG1 和 IgG2a 抗体滴度显著升高，脾细胞刺激后 IFN-γ 产量也明显增加。细胞因子分析显示，治疗组呈现 Th1 型免疫反应，寄生虫负荷通过 qPCR 检测显著降低，rLinKAP 治疗使寄生虫负荷降低了 75% ，优于当前治疗利什曼病的金标准药物米替福新（miltefosine）（降低 50%），表明 rLinKAP 在控制寄生虫感染方面具有良好的应用前景。
讨论
尽管针对 VL 的预防性和治疗性疫苗研究已开展多年，但目前仍无可用的人类疫苗，因此寻找新抗原并开发有效疫苗配方十分必要。LinKAP 通过反向疫苗学策略被发现，在利什曼原虫物种中高度保守，其相关序列也存在于锥虫属和内锥虫属基因组中。LinKAP 独特的氨基酸重复结构与其他原生动物的抗原和免疫原性蛋白相似，可能在寄生虫的细胞内寄生和免疫逃避中发挥作用。其包含的 TPH 和 TolA 结构域为预测功能提供了线索，虽然目前其功能尚未明确，但基于其结构和线粒体在寄生虫生物学中的重要性，值得进一步研究。免疫实验表明，rLinKAP 联合 Poly ICLC 能诱导 BALB/c 小鼠和仓鼠产生特异性 Th1 免疫反应，这种免疫反应的特征是 IFN-γ 产生、IL-10 水平低和 IgG2a 抗体占优势，免疫动物的寄生虫负荷显著降低。此外，rLinKAP 作为治疗性疫苗也能引发关键细胞因子的产生，增强对寄生虫感染的抵抗力。虽然治疗性疫苗可能需与化疗联合使用，但 rLinKAP 制剂已显示出显著降低寄生虫负荷的效果，未来结合现有化疗方案可能会进一步提高治疗效果。总体而言，LinKAP 是一种新型保守蛋白，rLinKAP 在预防和治疗利什曼原虫感染方面展现出良好潜力，值得深入研究。
