丁酸酸钠靶向 ToxT 蛋白抑制霍乱弧菌毒力因子表达：潜在抗霍乱新策略

霍乱（Cholera）由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）引起，危害严重且耐药问题突出。本文发现丁酸酸钠（SB）能抑制霍乱弧菌毒力因子表达，通过靶向 ToxT 蛋白，干预其与 DNA 结合，降低毒力基因（如ctxAB、tcpA）表达，在动物模型中效果显著，为抗霍乱治疗提供新思路。

　　

研究背景

霍乱是由霍乱弧菌引起的急性、严重脱水的腹泻疾病。自 2021 年中期以来，全球霍乱疫情呈上升趋势，2022 年仍在持续，至少 18 个国家报告了霍乱病例，死亡率令人担忧。在众多霍乱弧菌血清群中，只有 O1（经典和 El Tor 生物型）和 O139 血清群与霍乱的流行和大流行有关。

霍乱的临床症状主要由霍乱毒素（CT）和毒素调节菌毛（TCP）这两种关键毒力因子驱动。CT 属于 A - B₅家族毒素，能直接导致大量水样腹泻；TCP 则是肠道定植所必需的。这些毒力基因的协调表达受主调节因子 ToxT 的直接控制。ToxT 属于 AraC/XylS 家族转录激活因子，由两个结构域组成，其转录受 ToxRS 和 TcpPH 这两个膜定位复合物调节，而 TcpPH 又受 AphA 和 AphB 等激活剂的调控，这些激活剂会对细胞密度、厌氧环境和其他环境因素做出反应。

目前，霍乱的主要治疗方法是口服补液盐（ORS），以避免脱水，在严重病例中会使用抗生素来缩短病程。然而，由于抗生素耐药菌的出现和传播风险，世界卫生组织（WHO）并不推荐常规使用抗生素。此外，现有的霍乱疫苗疗效也并非 100%。因此，迫切需要新的临床干预措施来控制耐药菌的传播。

抗毒力药物作为一种替代方法正受到越来越多的关注。与抗生素不同，这类药物通过靶向病原体的毒力因子来削弱病原体，并进一步激活免疫系统来消除感染，对耐药菌株的选择压力较小，对共生微生物群的影响也较小。此前已有研究发现了一些针对毒力基因调控级联的小分子，如 toxtazin B、不饱和脂肪酸和利巴韦林等，同时一些草药产品和生物活性化合物也被报道能抑制毒力因子。短链脂肪酸（SCFA）中的丁酸在多种生理过程中发挥重要作用，其抗菌和抗毒力活性在多种病原菌中已有研究，但对霍乱弧菌的抗菌活性此前尚未有报道。本研究旨在筛选针对霍乱弧菌的潜在生物活性化合物，并探究其抗毒力活性的机制。

研究结果

1. 生物信息学筛选发现 SB 是潜在抑制剂：通过生物信息学虚拟筛选技术，将多种生物活性化合物与 ToxT 蛋白的结合口袋进行对接。结果显示，丁酸酸钠（SB）与 ToxT 蛋白具有最高的结合亲和力，为 - 7.68 Kcal/mol，它能与 ToxT 形成两个盐桥和一个氢键，基于此，SB 被选择用于后续的体外和体内实验。
2. SB 对细菌菌株活力和 HT - 29 细胞系细胞毒性的影响：测定 SB 对细菌菌株的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），并评估其对细菌生长速率的影响。结果表明，160 mM 的 SB 对 N16961 菌株具有完全杀菌活性，对其他菌株的杀菌活性更强。80 mM 的 SB 显著降低了所有菌株的活力，而 10 - 40 mM（亚 MICs）的 SB 与未处理的细胞相比，生长速率无显著差异。此外，SB 对大肠杆菌的抗菌效果不如对霍乱弧菌明显。同时，实验还评估了 SB 对哺乳动物细胞系的毒性，发现不同剂量（5 - 160 mM）的 SB 对 HT - 29 细胞无显著细胞毒性。
3. SB 抑制 CT 和 TcpA 的产生：鉴于 SB 与 ToxT 的相互作用预测，研究人员探究了 SB 对 ToxT 调控的毒力基因表达的影响。通过 GM1 - CT ELISA 检测发现，SB 能显著抑制所有三种霍乱弧菌菌株中 CT 的产生，且呈剂量依赖性。免疫印迹分析表明，SB 显著降低了 N16961 菌株中 TcpA 的水平。qRT - PCR 结果显示，SB 使霍乱毒素编码基因ctxAB和菌毛编码基因tcpA的表达显著下调，但不影响毒力调节基因（如toxS、toxR、tcpH、tcpP和toxT）的表达，且 SB 不影响 ToxT 蛋白的细胞水平，表明其影响毒力级联反应但不影响 ToxT 表达。由于 TcpA 对霍乱弧菌黏附肠道上皮细胞至关重要，实验发现 SB 处理后，霍乱弧菌对 HT - 29 细胞的黏附能力显著降低。
4. SB 与 ToxT 蛋白结合并影响其与靶启动子 DNA 的相互作用：通过荧光猝灭实验证实了 SB 与 ToxT 蛋白的直接结合。电泳迁移率变动分析（EMSA）结果显示，ToxT 与P_tcpA区域的结合呈浓度依赖性，而 20 mM 的 SB 能阻止 ToxT 与 DNA 的结合，40 mM 时结合完全被抑制，且 SB 存在时 ToxT 与P_tcpA的结合平衡常数K_d增大。染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，在生理条件下，SB 处理的霍乱弧菌细胞中，ToxT 在tcpA（P_tcpA）和ctxAB（P_ctxAB）启动子区域的占有率大幅降低，同时 ToxT 与其他毒力相关基因启动子的结合也受到影响，这表明 SB 强烈抑制 ToxT 与下游启动子 DNA 的结合。
5. SB 引发霍乱弧菌转录组的全局变化：利用 RNA - seq 技术研究 SB 对霍乱弧菌转录谱的全局影响。结果发现，与未处理条件相比，SB 处理显著上调了 53 个基因，下调了 95 个基因。其中，参与发病机制、代谢和转录 / 翻译调节因子的基因下调，而生物膜相关基因上调。通过 qRT - PCR 对随机选择的 12 个差异表达基因进行验证，结果与 RNA - seq 数据一致，表明 RNA - seq 数据可靠。
6. SB 在动物模型中显著降低霍乱弧菌的毒力属性：在乳鼠模型中，40 和 80 mM 的 SB 显著降低了霍乱弧菌 N16961 的肠道定植能力。在兔回肠袢模型中，SB 处理显著减少了细菌黏附、液体积累和 CT 产生，同时下调了毒力基因ctxAB和tcpA的表达。组织病理学分析显示，SB 处理的回肠袢微绒毛结构正常，炎症细胞因子浓度显著降低。而另一种丁酸衍生物三丁酸甘油酯（TB）在动物模型中对霍乱弧菌毒力无抑制作用。

讨论

尽管目前有抗生素和口服补液疗法，但霍乱弧菌仍然是一个重大的公共卫生问题，主要原因是抗生素耐药菌株的增加。开发针对关键毒力因子且不影响细菌活力的新治疗方法对管理这些耐药菌株至关重要。本研究表明，SB 能在体外和体内有效降低霍乱弧菌的毒力潜力，且对其活力影响较小。

在霍乱弧菌中，ToxR 调节子在发病机制中起核心作用，ToxT 蛋白直接激活主要毒力因子tcp和ctx的表达，是开发新型抑制剂的关键靶点。SB 通过与 ToxT 蛋白结合，影响其 DNA 结合能力，进而降低毒力基因的表达，这与之前不饱和脂肪酸等的作用机制类似。

RNA - seq 数据显示，SB 在抑制ctx和tcp基因表达的同时，使生物膜基因表达增加，这种现象在其他抗毒力研究中也有报道。此外，SB 还降低了一些与发病机制相关的辅助基因的表达，这些毒力因子的失调可能会降低霍乱弧菌的致病性。

与其他抗毒力化合物相比，SB 具有多种益处。它是肠道微生物发酵膳食纤维的主要代谢产物之一，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗自身免疫性疾病、癌症和神经系统疾病等。SB 能促进肠道上皮屏障功能，调节宿主黏膜免疫系统，还具有抗菌活性。然而，SB 也存在一些潜在的副作用，如对葡萄糖和脂质代谢的矛盾影响，以及可能影响宿主的食欲和进食行为。

本研究也存在一定的局限性。首先，虽然通过分子对接预测了 SB 与 ToxT 的结合位点，但还需要更深入的结构分析来明确其确切结合位置和对 DNA 结合能力的影响。其次，目前尚不清楚生物膜形成基因增加的具体机制。最后，本研究使用的乳鼠和兔回肠袢动物模型存在一定的局限性，需要更完善的哺乳动物模型来进一步验证研究结果。

综上所述，本研究首次报道了短链脂肪酸丁酸与霍乱弧菌毒力调节因子的直接结合，SB 抑制 ToxT 活性，在不降低细菌载量的情况下减轻霍乱弧菌的毒力，有望减少抗生素耐药性的产生。此外，ToxT 与其他病原菌毒力调节因子的同源性为开发广谱抗毒力药物提供了可能，为治疗多重耐药菌感染提供了新的选择。