μ-阿片受体揭示内体G蛋白激活的离散细胞机制：一种不依赖受体内化的信号传导新范式

这篇突破性研究揭示了μ-阿片受体（MOR）通过非经典机制激活内体Gi/o蛋白的分子机制。研究团队运用构象生物传感器（conformational biosensors）和纳米荧光素酶互补技术（NanoBiT），首次证实Gi/o在内体膜的激活不依赖受体内化或内体膜上的活性受体存在，提出了区别于Gs偶联GPCRs的"G蛋白运输"新模型，为理解区室化GPCR信号传导和开发位点偏向性药物（location-biased therapeutics）奠定理论基础。

　　

内体定位的G_i/o在MOR激活后增加
通过活细胞共聚焦显微镜观察发现，在Gi基因敲除（Gi-KO）的HEK293细胞中，荧光标记的G_i1-mNeonGreen在阿片类完全激动剂DAMGO刺激后显著富集于含有FLAG标记MOR（SSF-MOR）的内体。这种重定位现象在G_i/o亚型（G_i2、G_i3、G_oA、G_oB和G_z）中普遍存在。采用纳米荧光素酶互补技术（NanoBiT）定量分析显示，G_i1-LgBiT在内体的积累动力学明显快于MOR-LgBiT，暗示G蛋白转运可能独立于受体内化过程。

MOR与G_i/o在质膜和内体上的顺序激活
研究团队开发了两种关键生物传感器：识别MOR活性构象的纳米抗体Nb33-SmBiT，以及特异性检测活性态G_i/o的RAP1GAP效应域（Gi-ED-SmBiT）。实验数据显示，DAMGO诱导Nb33-SmBiT先后在质膜（LgBiT-CAAX标记）和内体（FYVE-LgBiT标记）上被招募，且两者具有相似的激动剂浓度依赖性。值得注意的是，Gi-ED-SmBiT同样检测到内体G_i/o激活，该信号可被百日咳毒素（PTX）完全阻断，在Gi-KO细胞中通过重新表达不同G_i/o亚型得以恢复。浓度反应曲线显示G_i/o激活的EC₅₀值左移于MOR激活，符合信号放大特征。

内体G_i/o激活不依赖内体膜上的MOR活性
通过比较膜渗透性拮抗剂纳洛酮和膜不渗透性拮抗剂CTOP的反转动力学，发现两者均能快速（t_?<1分钟）逆转质膜上的MOR和G_i/o活性。然而在内体上，纳洛酮逆转G_i/o活性的速度（t_?=2.8分钟）显著快于其对内体MOR活性的影响（t_?=9.4分钟）。更令人惊讶的是，CTOP逆转内体G_i/o活性的速度（t_?=3.3分钟）与纳洛酮无显著差异，这违背了"内体信号需要活性受体"的传统认知。

内体局部抑制MOR活性不影响G_i/o激活
研究构建了内体靶向的迷你G蛋白（FYVE-mApple-mGsi）和截短型RGS4（FYVE-mApple-RGS4Δ）。实验证明，内体定位的mGsi能选择性抑制内体MOR活性而不影响质膜信号，但出人意料地，它对内体G_i/o活性无显著影响。相比之下，RGS4Δ有效抑制内体G_i/o活性，表明质膜G蛋白激活是内体信号的前提。使用GRK2/3抑制剂compound 101进一步证实，虽然该化合物完全阻断MOR内化，却意外增强了内体G_i/o活性，这与G_s偶联GPCR的机制形成鲜明对比。

内源性MOR特异性从质膜触发内体G_i/o激活
在表达内源性MOR的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中，研究观察到更显著的药理学差异。Compound 101处理不仅没有抑制内体G_i/o活性，反而使其显著增强。三种激动剂（DAMGO、吗啡和PZM21）在内源性系统中均能诱导相当水平的内体G_i/o激活，尽管它们促进MOR内化的能力差异巨大。这些结果强烈支持存在一种饱和性机制，使得质膜激活的G_i/o能够独立于受体内化过程转运至内体。

讨论与展望
该研究提出了GPCR信号传导的两种并行模型：经典模型依赖受体内化后在内体膜上重新激活G蛋白（模型A），而新发现的机制则通过质膜激活的G蛋白直接转运至内体（模型B）。这种机制可能解释为何弱内化激动剂如吗啡仍能产生持久生理效应。研究开辟了多个新方向：G_i/o从质膜到内体的转运路径、内体膜环境延长G蛋白活性状态的分子基础，以及内体定位的G_i/o效应器识别等。这些发现对理解阿片类药物作用机制和开发新一代靶向药物具有深远意义。