Design and Production of Geranylated Cyclic Peptides by the RiPP Enzymes SyncM and PirF：开启新型抗菌肽研发新征程

抗生素耐药性日益严重，急需新型抗菌剂。研究人员利用 RiPP 途径，以 SyncM 和 PirF 酶为工具生产类非核糖体肽（NRP）。结果显示，二者成功修饰模板，产生脂化环肽。该研究为设计新型基因编码 NRP 模拟物提供可能，助力新生物活性肽筛选。

　　在医疗领域，抗生素耐药性问题愈发严峻，如同一场没有硝烟的战争，严重威胁着人类健康。目前，临床上许多重要的抗生素，如达托霉素（daptomycin）和多粘菌素 B（polymyxin B），都属于非核糖体肽（NRP） 。它们结构复杂，具有强大的抗菌活性，能有效对抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引发的感染。然而，NRP 如同神秘而难以捉摸的宝藏，想要挖掘出新型 NRP 类似物并非易事。传统的生成方法成本高昂且效率低下，这使得寻找新的抗菌药物迫在眉睫。

在此背景下，来自未知研究机构的科研人员挺身而出，踏上探索新型抗菌剂的征程。他们聚焦于核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs），这是一类结构多样、生物活性广泛的天然产物，因其基因编码的特性，在突变和修饰方面具有独特优势。研究人员巧妙地利用 SyncM 和 PirF 这两种 RiPP 酶，开展了一项极具创新性的研究。

最终，研究取得了令人瞩目的成果。SyncM 和 PirF 酶成功修饰了模板，二者协同作用产生了脂化环肽，这些肽与脂肽抗生素极为相似。这一成果意义重大，为设计新型基因编码的 NRP 模拟物提供了可能，开启了高通量筛选新生物活性肽的大门，有望为解决抗生素耐药性问题带来新的曙光。该研究成果发表在《Biomacromolecules》杂志上。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在分子克隆方面，他们通过设计引物，将优化后的核心肽序列插入载体构建质粒；利用大肠杆菌表达系统，表达前体肽和相关酶；采用 Ni-NTA 琼脂糖柱、PD - 10 脱盐柱和 C18 树脂柱等进行肽的纯化；运用 MALDI - TOF 质谱（Matrix - Assisted Laser Desorption/Ionization Time - of - Flight Mass Spectrometry）分析肽的修饰情况；借助碘乙酰胺（IAA）检测肽的环化状态；通过琼脂扩散法评估肽的抗菌活性。

研究结果如下：

• 组装新型 RiPP 工具盒：研究人员精心挑选了一系列具有不同长度和结构脂质尾以及不同大小大环的环状抗菌 NRP 肽作为模板。SyncM 因其能引入与所选 NRP 中大环结构相似的羊毛硫氨酸（lanthionine）环，且底物特异性广泛，被选中用于引入大环结构。PirF 等 prenyltransferases（PTases）因对肽底物和 prenyl 基团具有高度的混杂性，且无需识别前导肽，被用于引入 N 端疏水链，其中 PirF 成为探索 RiPP 脂化潜力的首选测试酶。
• SyncM 向 NRP 模拟肽中引入大环：研究人员设计了带有特定前导肽和核心肽的构建体，核心肽基于所选 NRP 模板设计，引入 C 端半胱氨酸残基和苏氨酸或丝氨酸以形成（甲基）羊毛硫氨酸环，并插入酪氨酸（Y） - 基识别基序以利于 N 端脂化。经 MALDI - TOF 质谱分析和 IAA 检测，SyncM 成功催化了所有测试肽的（甲基）羊毛硫氨酸环形成，尽管效率有所差异，形成的大环大小在 4 - 11 个氨基酸之间。
• PirF 对 NRP 脂质尾的结构模拟：PirF 在大肠杆菌中经分子伴侣辅助成功实现可溶性表达，其活性通过以 YYY 为底物和香叶基焦磷酸（GPP）为 prenyl 供体的反应得以验证。MALDI - TOF 质谱分析表明，PirF 能够将香叶基引入多种含酪氨酸的设计肽中，且在不同位置的酪氨酸残基上均能发生脂化，展现出广泛的底物特异性。不过，具体修饰的酪氨酸残基位置还需进一步通过 LC - MS/MS 分析确定。
• 探索 SyncM 和 PirF 的混杂性：研究人员通过设计新的肽，如将大环从 C 端转移到 N 端的反向 brevicidine - 模拟物，以及减少 PirF 识别基序的 SyCPA12 - Y - 模拟物突变体和 Malacidin - Y - 模拟物突变体，来验证这两种酶的混杂性。结果显示，SyncM 能够在新设计的肽中成功催化环化，PirF 能够修饰与羊毛硫氨酸大环直接相邻的酪氨酸残基，甚至是反向 brevicidine 模拟物 C 端的酪氨酸残基，这进一步证明了它们的广泛底物特异性。
• 抗菌活性检测：对生成的 NRP 模拟物进行琼脂扩散抗菌活性检测，发现只有 SyCPA12 和反向 brevicidine 模拟物表现出抗菌活性。进一步研究表明，仅含大环的模拟物对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌 168 有抗菌活性，且线性和环状形式的活性有所不同。脂化后的 brevicidine - 模拟物突变体抗菌活性增强，但由于脂化肽溶解度低，整体抗菌效果仍有待提高。

在研究结论和讨论部分，SyncM 形成不同大小环的能力以及 PirF 对不同位置酪氨酸残基的有效香叶基化，充分展示了这两种酶广泛的底物特异性，它们有望成为组合 RiPP 修饰工具盒中的得力工具。二者协同作用生成大环脂化肽，证明了通过杂交 RiPP 修饰平台创建非核糖体脂肽类似物的可行性。PirF 作为 RiPP 脂化工具，仅需核心肽序列中的酪氨酸残基即可实现脂化，这一特性使其区别于其他脂化酶。尽管其脂质供体目前局限于香叶基焦磷酸，但它在调节肽的疏水性和药代动力学方面具有重要价值。该研究为生成结构多样的肽类似物文库提供了有效方法，搭建了一个便于活性筛选、发现和开发新型生物活性肽的优质平台，在生命科学和健康医学领域具有重要的研究价值和应用前景，为未来抗菌药物的研发开辟了新的方向。