奎宁-查尔酮杂合体作为P-糖蛋白强效抑制剂诱导EBC-1细胞凋亡的机制研究

本研究针对肿瘤多药耐药(MDR)难题，设计合成新型奎宁-查尔酮杂合体AD-12/AD-13，发现其通过激活caspase-3/7/8通路诱导肺鳞癌细胞凋亡，并短期抑制P-gp外排功能(IC50<2?μM)，为开发兼具细胞毒性和逆转MDR的双功能抗癌药物提供新策略。

　　

在肿瘤治疗领域，多药耐药(MDR)犹如一道难以攻克的壁垒，其中P-糖蛋白(P-gp)过度表达导致的药物外排是主要机制之一。传统化疗药物往往"力不从心"，而天然产物结构改造正成为突破这一瓶颈的新思路。奎宁作为金鸡纳树皮提取的生物碱，不仅具有百年抗疟史，近年更被发现能通过结合TRAF6蛋白抑制TAK1信号通路发挥抗癌作用；查尔酮则是植物多酚类化合物，可通过抑制微管聚合、调控表观遗传等多途径触发肿瘤细胞凋亡。有趣的是，这两类分子均被报道具有P-gp抑制潜力，但如何将二者的优势"强强联合"，仍是亟待解决的科学问题。

为此，匈牙利的研究团队创新性地将奎宁骨架与不同修饰的查尔酮通过三唑连接桥共价偶联，构建出AD-12/AD-13等杂合分子。发表在《Biomedicine》的这项研究揭示，这些"分子杂交体"不仅能高效杀伤肺鳞癌细胞，还能巧妙阻断肿瘤细胞的"排毒泵"P-gp，实现"一箭双雕"的抗癌效果。

研究采用三大关键技术：通过alamarBlue法测定72小时IC₅₀值筛选活性化合物；利用CellEvent?试剂实时监测caspase-3/7激活动力学，结合Vybrant?试剂盒检测caspase-8活性；采用钙黄绿素-AM蓄积实验结合流式细胞术评估P-gp功能抑制，同时用PE标记抗体检测膜表面P-gp表达量。

【AD分子对EBC-1细胞增殖的显著抑制作用】
在A2058黑色素瘤、EBC-1肺鳞癌和MCF-7乳腺癌三系筛选中，含1,4-二取代苯环的AD-12(IC₅₀ 0.88?μM)和1,2-二取代苯环的AD-13(IC₅₀ 1.60?μM)对EBC-1细胞最具杀伤力，效果优于临床用药卡铂。

【AD-12/AD-13通过caspase途径诱导凋亡】
实时成像显示25?μM处理组在12-18小时即触发caspase-3/7暴发式激活，72小时完全消融细胞。流式检测发现2.5?μM即可显著升高caspase-8活性(>70%)，Annexin V/7-AAD双染证实25?μM处理24小时可使晚期凋亡细胞占比超88%。

【ROS水平与P-gp功能调控】
25?μM处理使细胞内H₂O₂水平提升3倍，但低浓度无此效应。钙黄绿素蓄积实验显示4小时即可抑制P-gp外排功能，但流式检测表明P-gp膜表达量保持稳定，证实为功能性抑制而非表达下调。

这项研究开创性地证明：奎宁-查尔酮杂合体通过"双通路激活"机制——既诱发caspase级联凋亡，又短期阻断P-gp外排功能。特别值得注意的是，AD-12/AD-13在2.5?μM即可有效杀伤肿瘤细胞，且不引发显著氧化应激，预示其可能具有较宽的治疗窗口。虽然AD-13在25?μM会反常升高P-gp表达，这恰提示其构效关系的复杂性：1,2-二取代苯环带来的空间位阻可能影响分子与靶点的持续结合。该研究为开发新一代"抗肿瘤-逆转耐药"双功能药物提供了关键理论依据，后续需开展非肿瘤细胞毒性比较及体内实验验证。