综述：推进精准耳医学：利用动物模型洞察疾病并推动治疗创新

本文聚焦内耳疾病基因治疗，阐述了动物模型在研究内耳疾病机制、评估治疗策略中的关键作用。探讨了基因治疗的多种策略，如基因补充、编辑等，同时分析了面临的挑战，为内耳疾病的精准治疗提供了全面的研究思路和方向。

　　

听力损失现状与研究意义

听力障碍是全球最常见的感觉缺陷之一，影响着约 4.66 亿人（占世界人口的 5%）。先天性听力损失影响约五百分之一的儿童，年龄相关性听力损失则困扰着近三分之二的 70 岁以上老人。其成因复杂，涉及多达 1000 种不同基因，目前尚无治愈感音神经性听力损失的方法。当前临床治疗手段，如助听器和人工耳蜗，虽有帮助，但无法恢复正常听力或解决根本病因。因此，深入了解疾病机制，开发更有效的治疗方法迫在眉睫。

内耳结构与听力形成机制

内耳作为将头部和身体运动以及声波转化为电信号并传递给大脑的感觉器官，由前庭和耳蜗组成。前庭负责检测平衡相关运动，耳蜗则专注于声音检测。在耳蜗的核心部位是柯蒂氏器（organ of Corti），它包含内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）。内毛细胞约 3000 个，呈单列排列，是主要的感觉受体，将声音引起的机械振动转化为电信号传至大脑；外毛细胞有 9000 - 12000 个，排列成三排，通过电运动放大声音刺激，增强耳蜗的敏感性和频率选择性，这对于在嘈杂环境中辨别语音至关重要。

耳蜗具有严格控制的音调拓扑组织，特定频率在其螺旋结构的不同位置进行处理。高频声音（人类上限为 20kHz）在基部检测，此处基底膜和盖膜结构以及相关支持细胞和感觉毛细胞窄而硬；低频声音（人类下限为 20Hz）在顶端感知，此处细胞和结构更宽且更灵活。这种从基部到顶端的机械性能梯度确保了精确的音调频率辨别，从外周器官一直维持到听觉皮层。

值得注意的是，内耳的组织和组成在不同物种间存在差异。哺乳动物内耳经过 5 亿多年的进化，虽具备了卓越的听力能力，但也失去了像鱼类那样毛发细胞的再生能力。在哺乳动物中，包括人类，毛发细胞及其伴随的听觉神经元在出生时数量固定，任何损伤都可能导致不可逆的听力损失。

听力损失的疾病建模与生物标志物研究

听力损失是一种极其异质性的疾病，约有 1000 种不同基因可能与之相关。临床上，听力障碍可在任何年龄出现，可分为非综合征性听力损失（isolated，non - syndromic hearing loss）和综合征性听力损失（syndromic hearing loss），还可根据严重程度分为轻度（21 - 40 分贝听力级，dB HL）、中度（41 - 70 dB HL）、重度（71 - 90 dB HL）或极重度（大于 90 dB HL）。非综合征性听力损失又可根据遗传传递模式分为常染色体显性（DFNA）、常染色体隐性（DFNB）、X 连锁（DFNX）或 Y 连锁（DFNY），其中常染色体隐性形式（DFNB）约占先天性（早发性）遗传性耳聋病例的 80%，而后天性和迟发性形式则更常与常染色体显性（DFNA）模式相关。目前，已确定约 140 个基因与人类孤立性听力损失明确相关，相关研究仍在不断探索新的基因。

临床研究（如非侵入性听力和平衡测试、成像）虽能提供内耳功能障碍的信息，但在确定听力和平衡缺陷的准确主要原因或理解导致感觉缺陷的事件序列方面存在局限性。捐赠内耳的体外分析虽能提供部分疾病特定致病阶段的见解，但适用范围有限。因此，动物模型对于克服这些局限性、推进对内耳健康与疾病生物学的理解至关重要。小鼠因与人类在遗传和生理上的相似性，成为研究听力损失最广泛使用的动物模型。近 99% 的小鼠基因在人类中有同源基因，且小鼠寿命短、繁殖容易，便于在可控环境下研究。通过对小鼠突变体的研究，已发现和研究了众多听力损失（HL）基因，国际小鼠表型联盟（IMPC）更是致力于为小鼠基因组中的每个基因生成无效突变并进行综合表型特征分析。目前，对耳聋动物模型的研究已确定了与人类孤立性听力损失相关的基因和位点在七个主要疾病途径中的功能分层，包括毛束发育和功能、突触传递、细胞间粘附和维持、离子稳态、细胞外基质、氧化应激和线粒体缺陷以及转录调控。

评估听力恢复的客观指标

评估听力损失和治疗干预的疗效需要可靠、客观和多维度的结果指标。动物模型通过整合分子、形态、功能和行为分析，为将临床前研究结果转化为人类应用提供了基础。

1. 功能听觉评估：客观听觉测量对于评估动物模型和人类的听力功能至关重要。听觉脑干反应（ABR）测试通过检测声音刺激沿听神经和脑干产生的电活动来评估听力敏感性，其阈值反映了能引起可检测神经反应的最低声音强度，波形还能揭示神经传导和突触效能的信息。畸变产物耳声发射（DPOAE）测试则通过检测耳蜗放大器对双音刺激产生的低水平声音来评估外毛细胞（OHC）功能，可区分感觉细胞功能和更广泛的听觉通路活动。两者结合能全面评估听觉敏感性和耳蜗健康状况。行为学检测如听觉惊吓反应（ASR）可评估听觉阈值和中枢听觉处理能力，其变体如前脉冲抑制（PPI）和间隙诱导的听觉惊吓前脉冲抑制（GPIAS）能揭示标准电生理方法可能遗漏的听觉处理缺陷。更精细的行为技术，如操作条件反射范式（如 Go/No - Go 任务）可构建行为听力图并测量时间分辨率，恐惧条件反射协议则通过动物的条件反应衡量听觉感知。在人类临床环境中，鼓室图可评估中耳功能，频率跟随反应（FFR）能反映脑干对周期性声刺激的锁相能力，这些非侵入性测试对于监测治疗效果和作为从动物模型到人类患者的转化基准至关重要。
2. 分子和细胞分析：除功能评估外，分子和细胞研究对于理解听力损失机制和评估基因治疗的生物学疗效至关重要。在动物模型中，使用荧光染料（如 FM1 - 43）可评估毛细胞的机械电转导（MET）通道活性，直接测量感觉转导机制的功能。电生理方法（如膜片钳记录）可分析耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元的离子通道活性。耳蜗电图（ECochG）记录耳蜗和听神经的电位，包括总和电位和复合动作电位（CAP），能揭示神经同步性和听觉外周的功能完整性。测量耳蜗微音器电位（CM）可了解外毛细胞产生的受体电位，评估从机械到电的转换过程。内淋巴电位（EP）测量可评估耳蜗内的电化学梯度，反映血管纹的功能状态。此外，微电极技术还可监测耳蜗液中的氧和 pH 水平，反映与耳蜗健康和治疗诱导恢复相关的代谢和离子变化。
3. 结构和形态评估：形态分析能直接观察组织完整性和治疗结果。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）可提供耳蜗结构的高分辨率成像，揭示细胞形态和突触结构。免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）技术可可视化特定蛋白质标记，识别细胞类型特异性反应和突触完整性。耳蜗全组织制备有助于全面的解剖评估，包括毛细胞存活和损失模式的空间映射。体内成像技术（如光学相干断层扫描（OCT）、多光子和共聚焦显微镜）可在不进行侵入性组织学分析的情况下监测疾病进展和治疗反应，在人类应用中，内耳磁共振成像（MRI）可提供结构信息，有助于评估耳蜗完整性和检测异常。综合功能、分子和结构评估对于准确评估听力恢复疗法至关重要，有助于确定可靠的生物标志物和结果指标，支持将基因疗法从动物模型成功转化为人类患者的应用。

内耳基因治疗：递送途径、载体和个性化治疗策略

基因治疗为治疗遗传性听力损失和其他内耳疾病带来了希望，其成功取决于选择合适的递送途径和载体，并在合适的疾病模型中进行充分验证。

1. 递送途径：内耳充满液体的环境对治疗药物的递送构成挑战，目前已在动物模型中测试了多种递送途径。圆窗膜（RWM）递送是一种常见且微创的方法，可直接进入外淋巴间隙，促进耳蜗扩散，但通常需要较高的治疗药物浓度。半规管造瘘术通过在半规管上开小孔进入迷路系统，与 RWM 注射相结合可增强成年小鼠耳蜗的扩散。耳蜗造瘘术是在耳蜗上开小孔，将药物直接递送至鼓阶或中阶，虽能实现高局部浓度，但技术复杂且存在手术创伤风险。椭圆囊注射主要针对前庭系统，在新生模型中对转导耳蜗细胞特别有效。枕大池注射是将治疗药物注入颅底的脑脊液（CSF），通过耳蜗导水管流入内耳。其他途径包括全身给药（虽可到达内耳，但存在脱靶效应和器官毒性风险）、中耳给药（常用于药物治疗，可通过生物可降解材料实现持续释放，但需高浓度和长时间暴露才能在内耳达到治疗水平）、宫内递送（可靶向发育中的耳蜗感觉细胞祖细胞）和腹腔注射（用于单剂量和重复剂量递送反义寡核苷酸（ASOs）治疗 USH1C（harmonin）缺乏症模型）。在人类治疗中，潜在的递送途径包括脑脊液、内淋巴囊、卵圆窗和 RWM，优化递送策略需考虑解剖因素、耳蜗成熟度和药物分布模式。
2. 载体：基因治疗的成功很大程度上取决于基因递送系统（载体）的有效性，载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体中，腺相关病毒（AAV）因具有非致病性、低免疫原性和对内耳细胞的高靶向效率，成为内耳基因治疗最有效的工具，但它的包装容量有限。为克服这一限制，正在探索双 AAV 载体和替代载体。腺病毒（AdV）和慢病毒（LV）载体可携带较大基因，能有效转导分裂和非分裂细胞，但存在免疫原性和潜在毒性风险。LV 载体可整合到宿主基因组中，实现分裂细胞中的长期表达，但插入突变风险和较高免疫原性令人担忧。目前研究致力于开发更安全的下一代慢病毒和腺病毒载体，如控制基因组整合和优化细胞嗜性，以减少脱靶效应。非病毒载体具有潜在的灵活性和安全性，包括由可生物降解聚合物制成的纳米颗粒和微球（如脂质体），相关研究旨在提高其基因递送效率。此外，核糖核蛋白（RNP）复合物因 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的进展受到关注，它可提供瞬时核酸酶活性，相比基于 DNA 的编辑剂递送，能降低脱靶活性风险。选择最佳的递送途径和载体需综合考虑治疗药物、靶细胞类型（毛细胞、支持细胞或神经元）、听力损伤程度和发病时间以及治疗目标（保护、预防、恢复或替换受损细胞）。

内耳疾病基因治疗的进展：迈向个性化耳医学

针对听力损失类型和病因的多样性，基因治疗在纠正听力和平衡缺陷方面取得了进展，包括基因补充、编辑、RNA 疗法以及针对多种形式耳聋的基因独立方法。

1. 基因补充：基因补充疗法旨在递送功能性基因以补充缺陷基因，为治疗隐性突变和某些听力障碍中的功能丧失显性突变提供了有前景的策略。该方法借鉴了治疗遗传性失明的成功经验，如商业化的 Luxturna RPE65 - GT 用于治疗莱伯先天性黑蒙症。在小鼠先天性耳聋模型中，通过 AAV1 载体经圆窗递送功能性 Vglut3 基因，成功将听力恢复至接近正常水平。类似研究表明，AAV 介导的基因补充可有效纠正一系列内耳缺陷，恢复前庭功能。例如，在 clarin - 2（Clrn2）小鼠模型中，通过基因治疗成功解决了优化疗效、确保恢复稳定性、确定治疗窗口和确认特定突变致病性等问题。临床前动物模型研究强调了确定最佳治疗窗口的重要性，早期基因递送往往能实现更有效和持久的听力恢复。对于较大的耳聋基因（如 OTOF、STRC、TMC1、PCDH15 和 MYO7A），双 AAV 载体系统被用于解决 AAV 包装容量的限制。此外，开发具有高转导效率和特定细胞嗜性的衣壳，以及选择合适的启动子以优化靶向特异性和表达水平，是提高基因治疗安全性和有效性的重要策略。
2. 基因组编辑治疗特定耳聋突变：CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的进展为靶向特定遗传缺陷提供了精确方法，为内耳治疗开辟了新途径。在贝多芬小鼠模型中，使用 CRISPR/Cas9 靶向 Tmc1 基因的显性突变，实现了显著的听觉恢复、细胞存活改善和相关神经支配的保存。此外，CRISPR/Cas9 还被用于选择性靶向 ATP2B2、TMC1 和 KCNQ4 等基因的显性突变等位基因，取得了良好效果。除了利用 Cas9 的核酸酶活性破坏突变等位基因，基于同源介导的末端连接（HMEJ）机制修复突变等位基因的研究也取得了进展，如在 Klhl18 隐性听力损失模型中的应用。AAV 介导的碱基编辑在 GJB2 突变模型中成功恢复了耳蜗间隙连接，为遗传性听力损失的治疗提供了新策略。在 RNA 水平，Cas13 等 RNA 靶向酶被用于编辑突变转录本，在 MYO6 显性耳聋、Tmc1 Bth 突变和 OTOF 突变导致的隐性听神经病模型中，均取得了一定的听力恢复效果。虽然这些基因编辑策略在治疗遗传性内耳疾病方面展现出巨大潜力，但在应用于人类临床试验之前，仍需解决核酸酶特异性和安全、高效递送方法等挑战。
3. RNA - 基于疗法：RNA - 基于疗法在不同的耳聋动物模型中也得到了探索。反义寡核苷酸（ASOs）在治疗 Usher 综合征模型中，成功纠正了缺陷 RNA 剪接，恢复了听觉和前庭功能。RNA 干扰（RNAi）则被用于选择性沉默显性耳聋中的突变基因，在不影响健康等位基因的情况下保留正常听力功能。
4. 基因独立方法：鉴于涉及听力损失的基因众多，开发基因独立疗法成为研究重点。一种策略是再生听觉毛细胞，过表达 Math1（Atoh1）转录因子可将支持细胞转化为新的毛细胞，在小鼠和豚鼠等动物模型中部分恢复听力。然而，其长期疗效和在正确发育阶段产生毛细胞的一致性仍有待提高。研究发现，在成年小鼠中，单独过表达 Atoh1 效果不佳，结合细胞周期抑制剂 p27^Kip1的缺失或添加其他转录因子（如 GATA3 和 POU4F3）可能增强其效果。在治疗前庭毛细胞损失方面，通过递送小分子组合可触发毛细胞再生，并部分恢复前庭功能，但在对抗毒素和衰老导致的不可逆损伤方面的效果仍需进一步研究。另一种策略是进行保护性局部治疗，如增强耳蜗外毛细胞中烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的功能，可减少声学创伤后的听力损失；利用生长因子（如神经营养因子 - 3（NT - 3）和脑源性神经营养因子（BDNF））可保护耳蜗神经元和毛细胞，限制耳蜗突触病变的影响；CRISPR 介导的凋亡调节因子（如 HtrA2）的敲低可有效预防氨基糖苷类诱导的听力损失。但在将这些创新方法应用于人类之前，仍需在动物模型中进一步评估其安全性和有效性。

结论

内耳疾病基因治疗的发展离不开动物模型的研究，但将这些有前景的研究成果转化为人类临床应用仍面临诸多挑战。

1. 再生听觉毛细胞：再生或替换受损的听觉毛细胞是恢复听力的关键策略，但目前在长期疗效和毛细胞正确发育方面存在问题。研究非哺乳动物脊椎动物的毛细胞再生信号，可能为哺乳动物系统提供有价值的见解，但将这些机制应用于人类成人耳朵的非允许环境仍需探索。
2. 改进载体和递送方法：有效的基因治疗依赖于选择合适的载体和递送方法。新型病毒载体（如 AAV、AdV 和 LV）和非病毒载体（如脂质体、纳米颗粒和水凝胶）正在开发中，以提高靶向效率和安全性。评估这些载体的转导效率和安全性时，需考虑所选的递送途径。大型动物模型（如猪）因其与人类解剖结构相似，可用于优化递送策略和监测免疫反应。
3. 恢复耳蜗音调拓扑结构：恢复耳蜗的音调拓扑结构对于精确的声音频率辨别至关重要，有效听力恢复不仅需要纠正患病的耳蜗靶细胞，还需重建耳蜗的复杂音调组织。未来研究需明确功能恢复与再生细胞的分子和细胞特征之间的关系，以优化治疗效果。
4. 拓展可靠的动物模型：小鼠在评估内耳基因疗法中具有重要价值，但不能完全反映人类听力障碍的症状发作时间和疾病进展情况。大型动物模型（如猪、兔子和猕猴）更能模拟人类疾病进展，有助于缩小临床前研究与有效人类治疗之间的差距。个性化内耳治疗需根据个体患者的遗传特征和疾病特点进行调整，这需要深入了解潜在的病理生理机制、疾病进展过程和确定最佳治疗窗口。目前，众多基因治疗试验正在进行中，有望为罕见疾病的治疗带来革命性变化，但要实现比人工耳蜗更好的治疗效果，仍需克服诸多困难。实现内耳治疗从动物研究到人类