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在干细胞治疗中，常用的胎牛血清（FBS）存在诸多弊端。研究人员开展了利用白细胞滤器内容物制备人血小板裂解液（f-hPL）用于 MSC 扩增的研究。结果显示 f-hPL 能有效促进 MSC 生长，这为再生医学提供了可持续且高效的方法。
细胞移植治疗在多种疾病的康复中展现出巨大潜力，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）作为其中的重要一员，备受关注。在培养 MSC 的过程中，为了让干细胞能够成功扩增，往往需要在培养基中添加血液来源的补充剂。长期以来，胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）凭借其丰富的营养成分，成为了最常用的补充剂。然而，FBS 就像一把双刃剑，在带来便利的同时，也隐藏着不少麻烦。它存在着人畜共患污染的风险，可能会让接受治疗的患者产生免疫反应，而且从动物福利的角度来看，使用 FBS 也引发了诸多伦理争议。
为了解决这些问题，科研人员开始积极寻找替代 FBS 的物质。人 AB 血清虽然能避免人畜共患污染的问题，目前也有不少临床试验将其用于细胞扩增，但它依赖人力资源，成本较高，难以满足大规模干细胞产品生产的需求。这时，人血小板裂解液（Human Platelet Lysate，hPL）进入了人们的视野。hPL 含有多种生长因子，理论上是替代 FBS 的优质候选者，并且已经有一些临床试验将其应用于干细胞培养基中。可是，获取足够用于临床的人血小板并非易事，目前主要依靠血库中用于输血的血小板，而用于生产 hPL 的往往是过期的血小板浓缩物。随着对减少过期血液制品的重视，这类血小板浓缩物的数量预计会逐渐减少，这无疑限制了 hPL 作为细胞生长补充剂的应用。
就在大家为获取足够的 hPL 而发愁时，研究人员发现了一个被忽视的 “宝藏”—— 白细胞滤器。白细胞滤器在血液制品生产过程中用于去除白细胞，防止因供体白细胞引发的免疫反应，完成使命后通常会被当作生物医学垃圾丢弃。但令人惊喜的是，这些滤器不仅能捕获白细胞，还截留了全血中约 30 - 99% 的血小板。基于此，日本北海道大学医院、日本红十字会等机构的研究人员大胆假设，能否将白细胞滤器作为血小板和血浆的新来源，用于生产 hPL 呢？于是，他们围绕这一假设展开了深入研究，相关成果发表在《Stem Cell Research & Therapy》上。
研究人员为了制备用于 MSC 扩增的 f-hPL，采用了一系列关键技术方法。首先，从日本红十字会北海道血液中心收集健康个体自愿捐献的血液，经过白细胞滤器处理后，对使用过的白细胞滤器进行反向灌注生理盐水，以收集其中残留的血液成分。之后，通过多次离心分离血小板（f-platelet）和上清液。在确定血小板裂解液最佳蛋白质浓度时，将 f-platelets 溶解在含有不同浓度过期新鲜冰冻血浆（FFP）的过滤上清液中，经过多次冻融循环和离心过滤操作，得到不同蛋白质浓度的血小板裂解液。最后，将符合条件的 f-platelet 和 f-plasma 混合，再经过冻融循环和过滤，制备出 f-hPL。此外，研究人员还使用了多种细胞分析技术，如细胞计数、ELISA 检测肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）表达、蛋白质组学分析以及细胞衰老分析等，来评估 f-hPL 对 MSC 的影响。
下面来看具体的研究结果：
- f - 血小板和上清液的收集：研究人员对 596 个白细胞滤器进行评估，发现从单个白细胞滤器中平均可收集到3.5±0.6×1010个 f - 血小板，收集效率为 37.1 ± 5.3%，同时每个滤器中白细胞和红细胞的污染水平分别为4.1±4.0×104个细胞和11.3±4.5×106个细胞。
- 血小板裂解液最佳蛋白质浓度的确定：通过评估不同蛋白质浓度的血小板裂解液对细胞扩增的影响，研究人员发现蛋白质浓度在 27 - 60mg/mL 范围内，细胞扩增效果无显著差异，但 60mg/mL 组与 6mg/mL、18mg/mL、FBS 和 FFP 组相比，差异明显。60mg/mL 组细胞数量的增加倍数几乎是 FBS 组的四倍。显微镜分析显示，6mg/mL 组细胞形态异常，而 27mg/mL 和 60mg/mL 组呈现正常的纺锤形形态。综合考虑，后续实验选择蛋白质浓度为 27mg/mL 的血小板裂解液。
- 小规模和大规模 f-hPL 对 MSC 扩增质量的影响：小规模（约 15 个滤器）和大规模（约 290 个滤器）生产的 f-hPL 都能成功扩增 MSC，且与市售 hPL 或 FBS 相比，可使 MSC 数量增加四倍。显微镜观察发现，大规模 f-hPL 扩增的 MSC 呈现典型的纺锤形形态，并且其表面标记符合国际细胞与基因治疗学会（International Society for Cell & Gene Therapy，ISCT）的标准。
- f-hPL 对 MSC 性能的影响：在比较不同补充剂对 MSC 性能的影响时，研究人员发现，与 FBS 和人 AB 血清相比，f-hPL 扩增的 MSC 中 HGF 表达相似或更高。蛋白质组学分析显示，f-hPL 组与 FBS 组相比，多数蛋白质表达相似，但也有部分蛋白质表达存在差异。基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析表明，f-hPL 组中 RNA 剪接和 mRNA 加工上调，细胞外基质组织下调，暗示细胞增殖活跃。同时，f-hPL 处理的 MSC 中干性相关蛋白表达显著升高，胶原蛋白基质蛋白表达降低，表明细胞迁移能力增强，更有利于细胞扩增。此外，在细胞衰老分析中，f-hPL 在 P12 之前促进细胞扩增的效果明显优于 FBS 和人 AB 血清，β - 半乳糖苷酶（β-gal）表达分析证实，f-hPL 处理的 MSC 在相同代数下衰老程度更低。
- 临床规模细胞扩增实验：利用自动化细胞培养系统，研究人员使用 f-hPL 成功扩增了 MSC。从志愿者获取的骨髓样本在含有 f-hPL 的培养基中培养，细胞数量达到4.6?12.6×107个，细胞活力大于 90%，且细胞具有合适的表面标记和分化潜能。
综合以上研究结果，研究人员得出结论：源自白细胞滤器的 f-hPL 对 MSC 具有强大的扩增能力。这种利用废弃血液成分进行再生医学的方法，既可持续又高效，具有巨大的治疗潜力。在讨论部分，研究人员也指出了研究存在的局限性。例如，目前还无法确定上清液中促进 f-hPL 增殖能力的具体蛋白质，也未评估 f-hPL 的最佳血小板浓度，并且由于日本血液制备中未使用其他白细胞滤器（如血小板保留滤器），无法对其进行评估。但尽管存在这些不足，该研究依然为再生医学领域提供了新的思路和方法，为未来的研究和临床应用奠定了重要基础。它让人们看到了利用废弃资源推动医学进步的可能性，有望在干细胞治疗等领域发挥重要作用，为更多患者带来希望。
