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为解决集胞藻 PCC 6803 生产异丁烯产量低的问题，研究人员开展 α- 酮异己酸双加氧酶（RnKICD）的蛋白质工程研究。结果显示，F336V 突变使异丁烯产量提高 4 倍。该研究为提升异丁烯生物合成提供有效策略。
在能源与化工领域，异丁烯是个 “潜力股”。它不仅能量密度高、燃烧性能好，能作为喷气燃料的优质前体，还是合成丁基橡胶、对苯二甲酸等众多工业产品的关键原料。当前，异丁烯主要从石油烃蒸汽裂解中提取，这种传统方式不仅依赖不可再生的石油资源，还会对环境造成较大压力。于是，微生物发酵生产异丁烯的新路径应运而生，其中利用单细胞蓝藻集胞藻 PCC 6803 和来自挪威大鼠的 α- 酮异己酸双加氧酶（RnKICD）进行光驱动生物合成异丁烯的研究备受关注。
然而，这条看似光明的道路却遇到了 “拦路虎”。RnKICD 存在底物混杂的问题，它既能与 ρ - 羟基苯丙酮酸（HPP）反应生成尿黑酸，又能与 α - 酮异己酸（KIC，异丁烯合成的前体）反应，这就导致 KIC 转化为异丁烯的效率大打折扣，异丁烯的产量难以满足工业需求，限制了该技术的大规模应用。
为了攻克这一难题，来自瑞典乌普萨拉大学（Uppsala University）的研究人员挺身而出。他们开展了一项旨在通过蛋白质工程优化 RnKICD，进而提高集胞藻 PCC 6803 中异丁烯产量的研究。研究人员通过理性和半理性设计，构建了 RnKICD 突变体库，并对其进行筛选和表征。最终发现，特定的突变能够改变酶的底物选择性，显著提高异丁烯的产量。这一研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为微生物合成异丁烯技术的发展注入了新的活力，有望推动生物能源领域的重大变革。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是同源建模（Homology modeling）与分子对接（Molecular docking），通过该技术构建 RnKICD 的结构模型，分析其与底物的相互作用，为突变位点的选择提供理论依据；二是定点饱和突变（Site - saturation mutagenesis），构建突变体库，筛选具有潜在优势的突变体；三是多种酶活性检测技术，如利用 2,4 - 二硝基苯肼（DNPH）法测定底物消耗情况，通过气相色谱 - 质谱联用仪（GC - MS）检测异丁烯生成量等，全面评估突变体的性能。
研究结果
- 底物混杂限制异丁烯合成：RnKICD 能同时以 KIC 和 HPP 为底物，HPP 会竞争 KIC 转化的活性位点，成为体内异丁烯生物合成的瓶颈。基于此，研究人员决定对 RnKICD 活性位点的氨基酸残基进行理性和半理性改造，期望提高底物选择性，促进异丁烯生产。
- 筛选突变位点：通过对 HPPD 酶活性位点相关研究的分析，结合同源建模和分子对接技术，研究人员锁定了 Q251、Q265、Q334、F336 和 N363 等可能影响底物结合的关键残基。针对 F336 和 Q334 进行定点饱和突变，对 Q251E、Q265E 和 N363A 进行理性设计突变，以探究这些位点突变对底物选择性的影响。
- 筛选突变体库：对定点饱和突变产生的突变体库进行筛选，依据高 KIC 消耗活性和底物消耗改变这两个标准挑选潜在突变体。结果发现，Q334 突变体（如 Q334S 和 Q334T）增加了对 HPP 的选择性，破坏了 KIC 的消耗；而 F336V 突变体对 KIC 的选择性增强，HPP 消耗降低约 7 倍，KIC 消耗仅下降 2 倍。
- 体外分析突变体：对 Q251E、Q265E、N363A 和 F336V 等突变体进行纯化和功能表征。结果显示，Q251E 和 Q265E 突变导致酶活性显著降低，几乎无法检测到 KIC 消耗和异丁烯生成；N363A 突变体对 KIC 的选择性增强，且异丁烯生成量与野生型相当；F336V 突变体虽然 HPP 消耗严重受损，但对 KIC 的选择性更高，不过 KIC 消耗和异丁烯生成速率较野生型有所下降。双突变体 F336V/N363A 完全阻断了 HPP 消耗，KIC 消耗和异丁烯生成维持在较低水平，但各突变体 KIC 转化为异丁烯的比例与野生型相近，表明 KIC 转化为异丁烯的过程催化混杂，且体外异丁烯生成受 HPP 抑制。
- 体内分析工程菌株：将野生型 RnKICD 及表现最佳的突变体基因导入集胞藻 PCC 6803，构建相应工程菌株。培养实验表明，各菌株生长无显著差异，但异丁烯产量不同。其中，Syn - F336V 菌株的异丁烯产量比基础菌株 Syn - RnKICD 提高了 4 倍，而 Syn - N363A 菌株产量显著下降，Syn - F336V/N363A 菌株与 Syn - RnKICD 产量相当。
研究结论与讨论
本研究通过半理性蛋白质工程策略，成功优化了 RnKICD 对 KIC 的底物特异性，提高了集胞藻体内异丁烯的产量。研究发现，Q251 和 Q265 对维持 RnKICD 活性至关重要；Q334 突变会破坏 KIC 转化为异丁烯的活性；F336 和 N363 则在调节底物选择性方面发挥重要作用，F336V 突变体有效提升了体内异丁烯产量。
这一研究成果意义重大。从基础研究角度，进一步明确了 RnKICD 底物选择性的分子机制，为深入理解酶的催化特性提供了新的视角。从应用层面，为微生物发酵生产异丁烯提供了切实可行的优化策略，有助于推动生物能源产业朝着可持续方向发展。同时，研究还强调了在设计体外酶促实验时，需充分考虑体内环境因素的重要性，为后续相关研究提供了重要的参考思路。
