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在细菌感染诊疗及生物安全监测中，全基因组测序（WGS）至关重要，但传统方法存在不足。研究人员对比多种 DNA 提取和文库制备方法，发现玻璃珠破碎法（GBD）和部分文库制备试剂盒效果良好。这为优化测序流程、提高检测效率提供依据，助力精准诊疗与生物安全防控。
在微生物的神秘世界里，准确识别和了解细菌对于人类健康和生物安全意义重大。全基因组测序（Whole-genome sequencing，WGS）就像一把神奇的钥匙，能够打开细菌遗传信息的宝库，帮助人们快速精准地识别医院感染病原体、监测公共卫生事件、追踪疾病传播路径，甚至在防范生物恐怖威胁方面也发挥着关键作用。然而，传统的细菌基因组测序方法却存在诸多 “烦恼”。它依赖复杂的试剂盒从液体培养物中提取 DNA，不仅操作繁琐、耗费时间，而且难以满足在突发感染事件中快速检测的需求。此外，测序数据的质量也深受 DNA 提取和文库制备方法的影响，一旦前期准备工作没做好，后续的测序结果就可能大打折扣，无法准确反映细菌的真实遗传信息。
为了解决这些棘手的问题，来自比利时天主教鲁汶大学（Université catholique de Louvain）的研究人员 Bertrand Bearzatto、Jean-Fran?ois Durant 等人勇敢地踏上了探索之旅。他们精心挑选了三种具有代表性的细菌：芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、葡萄球菌属的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和肠杆菌属的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），这些细菌在临床感染和生物安全监测中都有着重要意义。研究人员深入比较了四种 DNA 提取方法和四种文库制备试剂盒，试图找出最适合细菌全基因组测序的组合方案。经过一系列严谨的实验和深入的分析，他们发现不同的 DNA 提取和文库制备方法对 WGS 的质量影响巨大。例如，玻璃珠破碎法（Glass bead disruption，GBD）在三种细菌的测序中都表现出色，而热激裂解（Heat shock，HS）法却在面对蜡状芽孢杆菌时 “败下阵来”，无法获得足够用于测序的最终文库材料。在文库制备试剂盒方面，Illumina DNA Prep（DP）、Roche KAPA HyperPlus（KP）和 NEBNext? Ultra? II FS DNA Library Prep Kit（NN）能够产生高质量的测序结果，且 GC 偏差较小；Illumina Nextera XT（XT）试剂盒则存在显著的 GC 偏差，在对低 GC 含量细菌的测序中质量欠佳 。
这项研究成果发表在《BMC Genomics》上，为细菌全基因组测序提供了极具价值的参考。它让人们清楚地认识到，根据细菌细胞壁组成和 GC 含量选择合适的 DNA 和测序文库制备方法，对于获得高质量的高通量测序（High-throughput sequencing，HTS）结果至关重要。这不仅能够提高临床诊断的准确性，加快感染性疾病的诊疗速度，还能在生物安全监测领域发挥重要作用，有效防范生物恐怖威胁和传染病的爆发。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，针对不同细菌进行培养，获取实验所需样本。然后采用四种 DNA 提取方法，包括 HS、GBD，以及利用自动核酸提取仪（EZ1 Advanced，Qiagen）的两种方法（EZ1 和 EZ1-AMP）从单菌落中提取 DNA 。接着使用 Qubit 1X dsDNA 高灵敏度检测试剂盒对 DNA 进行定量和稀释。最后，选用四种不同的文库制备试剂盒（DP、XT、KP、NN），按照各自的操作说明进行文库制备，并在 Illumina 平台上进行测序。之后，通过参考基因组比对和从头组装（de novo assembly）两种生物信息学分析方法评估测序质量。
下面让我们详细了解一下研究结果：
- DNA 和文库制备结果：四种 DNA 提取方法都能为除蜡状芽孢杆菌 HS 法外的样本提供足够用于文库制备的 1ng DNA 。最终文库经过 9 - 14 个扩增循环，成功为表皮葡萄球菌和阴沟肠杆菌生成了足够用于 MiSeq 测序的材料，但蜡状芽孢杆菌采用 HS 法时无法获得足够材料。同时，所有文库制备的 PCR 重复率都极低，在 0 - 0.3% 之间。
- 基于参考基因组比对评估 WGS 质量：通过分析测序深度，研究人员发现阴沟肠杆菌部分质粒和染色体的测序深度相当，而表皮葡萄球菌质粒的测序深度比染色体高 3 - 500 倍。蜡状芽孢杆菌的质粒未获得测序结果，可能是该菌株在实验中丢失了质粒。进一步研究 GC 含量与测序深度的关系发现，DP、KP 和 NN 试剂盒不受 GC 含量影响，而 XT 试剂盒存在 GC 偏差，富含 GC 的区域测序更深。
- 使用从头组装分析评估 WGS 质量：在评估基因组组装能力时，研究发现使用 DP、KP 和 NN 试剂盒制备文库时，DNA 提取方法对 contig 数量影响不大，但 XT 试剂盒会产生更多 contigs。XT 试剂盒的 N50 值低于其他试剂盒，而使用 EZ1、EZ1 - AMP 和 GBD 提取 DNA 并结合 DP、KP 和 NN 试剂盒进行组装时，基因组比例较高（>95%），HS 法和 / 或 XT 试剂盒的基因组比例较低（60 - 95%）。除 HS 法外，其他方法的错配率都很低，NN 试剂盒的碱基识别性能尤其高。
研究结论和讨论部分再次强调了选择合适方法的重要性。GBD 法在文库制备中表现出色，与自动化提取效果相当；HS 法不适用于芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌，且在使用基于转座酶的试剂盒进行从头组装时效果不佳。不过，GBD 和 HS 作为低成本方法，对于资源有限的移动实验室仍有一定价值。DP 试剂盒和基于核酸内切酶的方法能产生高质量结果，XT 试剂盒则存在明显缺陷。这些结论为未来细菌全基因组测序提供了重要的实践指导，有助于科研人员和临床工作者更高效、准确地开展细菌研究和诊断工作，推动生命科学和健康医学领域的发展。
