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在细菌研究领域，DNA 甲基化对细菌的多种特性影响重大，但解码甲基化信号困难重重。研究人员利用纳米孔测序技术，分析四种与公共卫生相关细菌的甲基化谱。结果揭示了物种特异性甲基化模式，还开发了相关检测流程。这为深入探究细菌 DNA 修饰提供助力。
在微观的细菌世界里，隐藏着许多不为人知的秘密，其中细菌的 DNA 甲基化修饰便是一个神秘的领域。DNA 甲基化就像是细菌基因组的 “小助手”，它在细菌的致病性、对抗生素的耐药性以及躲避人体免疫系统的攻击等方面都发挥着重要作用。然而，想要揭开这个 “小助手” 的神秘面纱并不容易。随着科技的发展，实时纳米孔测序技术和碱基识别算法取得了显著进步，能够直接从原始信号数据中检测出修饰碱基，无需对 DNA 进行亚硫酸氢盐处理。但由于技术和方法的快速更新，解码甲基化信号依旧是个难题。在这样的背景下，为了更深入地了解细菌甲基化的奥秘，来自德国罗伯特?科赫研究所（Robert Koch Institute）、奥地利格拉茨医科大学（Medical University of Graz）、德国耶拿大学医院（Jena University Hospital）等多个研究机构的研究人员开展了一项重要研究。他们的研究成果发表在《BMC Genomics》杂志上，为我们认识细菌甲基化提供了新的视角。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是纳米孔测序技术（Nanopore sequencing），使用 Nanopore GridION 平台和最新的 R10.4.1 流动池化学技术对样本进行测序；其次，利用 Dorado v0.8.1 软件和特定的碱基识别模型对原始信号数据进行重新碱基识别；之后，通过一系列生物信息学工具，如 Filtlong、Rasusa、Flye、Medaka 和 Bakta 等对测序数据进行处理、组装和注释；最后，运用 Modkit 和 MicrobeMod 工具来检测甲基化模式和识别甲基化基序。研究样本来自之前一项评估基于纳米孔测序的细菌病原体基因分型可重复性研究中的四种细菌，包括粪肠球菌（Enterococcus faecium，EF）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），每个物种选取了三个菌株进行研究。
下面来看看具体的研究结果：
- 检测甲基化基序和位点：研究人员运用 MicrobeMod 和 Modkit 工具对 12 种细菌物种重新碱基识别和重新组装的数据进行分析。多数情况下，两种工具检测到的基序相同，但也存在差异。比如在 SA67 菌株中，Modkit 检测到两个基序，而 MicrobeMod 识别出的基序更宽泛、特异性较低。整体而言，Modkit 的结果更全面，但也存在未检测到某些低频基序的情况。此外，研究还发现了一些新的基序，不过像 TGGCCA 和 TCGA 这两个基序的甲基化水平较低，需要进一步研究。
- 基序检测的准确性和可重复性：不同实验室的三个重复样本检测结果显示，多数基序的甲基化情况在各重复样本中一致，但部分测序覆盖度较低的样本，如 EF22 和 SA62，存在更多未甲基化的情况。在单碱基水平上，6mA 修饰的碱基在多数样本的重复检测中能被一致识别，但 LM54 样本存在例外。5mC 和 4mC 的甲基化情况在肺炎克雷伯菌中较多，其中 5mC 在重复样本中的一致性较高，4mC 的变异性较大。
- 高甲基化基因和调控区域基序分析：通过计算基因的甲基化密度，研究人员发现肺炎克雷伯菌的 oriC 区域富含 6mA 碱基，rRNA 和 tRNA 基因富含 5mC 碱基。在其他物种中，也观察到 rRNA 和 tRNA 基因以及与翻译、核糖体结构和生物发生相关的基因具有较高的甲基化密度。此外，还发现一些基序在基因的启动子区域、起始和结束位置出现的频率较高。
- 评估潜在的甲基化诱导碱基识别错误：研究人员对比了不同碱基识别模型的结果，发现新的 v5 模型减少了 R 和 Y 碱基的歧义性，但某些样本，如 KP02 和 LM46，仍然存在问题。利用 Hammerhead 工具评估发现，新模型使大多数样本中潜在的修饰位点数量显著减少，但 KP02、LM46 和 SA67 仍有可识别的位点。
研究结论和讨论部分指出，纳米孔测序技术和相关方法能够全面检测细菌的甲基化基序和位点，但在识别甲基化不一致或低频出现的基序时仍面临挑战。研究还发现细菌的甲基化模式多为双链甲基化，这为未来开发更精准的基序识别算法提供了思路。高甲基化的 DNA 区域与基因调控和细胞功能密切相关，影响着核糖体功能、蛋白质合成等重要细胞过程。虽然甲基化检测在重复样本中的可重复性较高，但低覆盖度和部分甲基化模式仍会影响检测结果。新的碱基识别模型虽减少了链特异性歧义，但特定基序的碱基识别错误依然存在。这项研究为深入了解细菌的 DNA 甲基化修饰提供了丰富的数据和深刻的见解，有助于揭示细菌致病的分子机制，为开发新的抗菌策略和诊断方法奠定了基础，推动了细菌甲基化领域的研究进展。
