揭秘线虫睡眠调控机制：神经肽 FLP-11 与受体 DMSR-1 的奇妙 “舞蹈”

本文聚焦秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），发现神经肽 FLP-11 通过受体 DMSR-1 调控睡眠。DMSR-1 在不同神经元发挥不同作用，参与睡眠起始与时长限制。该研究为理解睡眠调控机制提供新视角，对探索其他物种睡眠调控有重要意义。

　　

研究背景

睡眠对生物体至关重要，然而，睡眠活性神经元的神经传递如何诱导睡眠以及决定睡眠时长的机制仍未完全明晰。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，睡眠关键依赖于单个睡眠活性神经元 RIS，它通过释放 FLP-11 RF 酰胺神经肽来诱导睡眠，但 RIS 和 FLP-11 调控睡眠的具体方式，因其作用受体未被鉴定而尚不明确。

研究目的

本研究旨在探究秀丽隐杆线虫中 RIS 和 FLP-11 调控睡眠的具体机制，明确相关受体及信号通路，以及该机制在不同神经元中的作用差异。

实验方法

1. 筛选潜在受体：通过大规模体外筛选，确定 FLP-11 的潜在受体，其中 DMSR-1 被 FLP-11 激活的半最大有效浓度（EC₅₀）在纳摩尔至亚纳摩尔范围，活性较强。
2. 构建突变体并观察睡眠行为：培养 dmsr-1、frpr-8 和 dmsr-7 等突变体，利用琼脂糖水凝胶微流控 chambers 培养线虫，在 L1 停滞期对其睡眠行为进行成像，计算睡眠时长、睡眠周期长度和频率。
3. 监测钙活动：使用 GCaMP 监测 dmsr-1 (qn45) 突变体中 RIS 在睡眠 - 觉醒周期的钙活动，通过对齐睡眠周期和 RIS 钙瞬变来分析数据。
4. 基因敲除和过表达实验：构建 flp-11、dmsr-1 单突变体和双突变体，比较其睡眠表型；通过热刺激诱导 FLP-11 过表达，观察对睡眠的影响及是否依赖 DMSR-1。
5. 细胞特异性敲低研究：构建条件性敲低 dmsr-1 的线虫品系，在特定神经元亚群中进行 dmsr-1 的条件性敲低，测量睡眠相关指标及 hsp-12.6 表达。
6. 药理学干预：使用低浓度 aldicarb 处理线虫，观察对睡眠和 RIS 活性的影响。
7. 确定受体与 G 蛋白的耦合关系：在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中表达 DMSR-1，利用双电极电压钳（TEVC）测量受体激活后的反应，判断其与 G 蛋白的耦合关系。

实验结果

1. DMSR-1 对睡眠的必要性：dmsr-1 突变体在 L1 停滞期睡眠时长显著减少，睡眠周期的长度和频率均降低；RIS 钙活动在 dmsr-1 突变体中升高，表明 DMSR-1 对睡眠诱导至关重要，且对 RIS 有抑制作用。
2. FLP-11 与 DMSR-1 的关系：FLP-11 是 L1 停滞期睡眠所需的 DMSR-1 的主要激活剂，二者在同一通路发挥作用，FLP-11 过表达增加的睡眠依赖 DMSR-1。
3. DMSR-1 下游作用：dmsr-1 在 RIS 激活下游对睡眠至关重要，optogenetic 激活 RIS 实验表明，dmsr-1 突变体在 RIS 激活时睡眠未减少，而野生型线虫睡眠减少。
4. DMSR-1 与生存和基因表达的关系：dmsr-1 对 L1 停滞期的生存和保护性基因（如 hsp-12.6）表达至关重要，突变体中二者均显著降低。
5. DMSR-1 与 G_i/o的耦合：DMSR-1 是 G_i/o偶联受体，其被 FLP-11 - 3 激活后可通过 G 蛋白内向整流钾（GIRK）通道增加 K⁺电流，该反应可被百日咳毒素（PTX）阻断。
6. 不同神经元中 DMSR-1 的作用差异：在胆碱能神经元中敲低 dmsr-1 几乎消除睡眠，而在 GABAergic 神经元中敲低则使睡眠时长近两倍增加，且二者对 hsp-12.6 表达的影响相反。
7. 胆碱能信号与睡眠的关系：降低 RIS 下游的胆碱能信号对睡眠诱导至关重要，aldicarb 处理减少了睡眠且降低了 RIS 活动。
8. DMSR-1 在 RIS 中的作用：在 RIS 中敲低 dmsr-1 增加睡眠，且导致 RIS 钙活动增强和睡眠时长增加，表明其通过抑制 RIS 钙活动来限制睡眠时长。

研究结论

1. 本研究揭示了秀丽隐杆线虫中 RIS 释放的 FLP-11 通过激活 DMSR-1 调控睡眠，DMSR-1 在不同神经元中发挥不同作用，在胆碱能神经元中促进睡眠，在 GABAergic 神经元（尤其是 RIS）中抑制睡眠。
2. 该研究表明 RF 酰胺神经肽 - GPCR 信号通路可能是其他物种睡眠调控的保守机制，睡眠活性神经元的自我抑制可能是限制睡眠时长的保守方式，为深入理解睡眠调控机制提供了重要线索，也为研究其他物种的睡眠调控提供了参考模型。