揭秘adeN截短型鲍曼不动杆菌：流行特征、基因组奥秘与临床启示

这篇研究聚焦adeN截短型鲍曼不动杆菌（ATAB），通过 PCR 筛选、全基因组测序等方法，发现其在医院广泛流行，与碳青霉烯类和替加环素耐药相关，还影响患者预后，对防控医院感染意义重大。

　　

引言

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是重要的医院感染病原菌，能引发肺炎、脑膜炎、血流感染等严重疾病。它对多种抗菌药物耐药，尤其是碳青霉烯类，使得治疗手段受限。替加环素常作为治疗碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）的最后防线，但耐药菌株也不断出现，主要与 RND 外排泵（如 AdeABC、AdeIJK）过表达有关。

AdeN 作为 TetR 家族转录调节因子，对 AdeIJK 表达起关键调控作用。2017 年有研究发现临床鲍曼不动杆菌菌株adeN基因的 ISAba1插入，这种基因改变与替加环素耐药及菌株致死性增强相关。然而，adeN截短型鲍曼不动杆菌（ATAB）的流行病学特征以及感染患者的预后情况尚不清楚。本研究旨在填补这些空白，通过回顾性筛查、全基因组测序和临床数据分析，深入探究 ATAB 的相关特征。

结果

1. ATAB 在医院患者中普遍存在：2018 年 1 月至 2022 年 12 月，从某大型三级医院收集了 1834 株鲍曼不动杆菌临床分离株。PCR 筛选发现，26.5%（486/1834）的菌株携带截短的adeN基因。其比例在不同年份波动较大，2018 年 4 月达到峰值 64.9%（24/37）。ATAB 分离株主要来源于 ICU 患者的痰液标本。

对 2020 - 2022 年的 254 株 ATAB 和 119 株随机选取的adeN完整菌株进行全基因组测序（WGS）。结果显示，ATAB 分离株主要属于 IC2/ST2 克隆（96.5%，245/254） ，主要荚膜类型为 KL2（87.8%，223/254）；而adeN完整菌株的多位点序列分型（MLST）和荚膜类型更为多样，最常见的是 ST2 - KL7（66.4%，79/119），且未发现 KL2 克隆。进一步分析荚膜类型随时间的分布，发现adeN完整的 KL7 菌株流行率较为稳定，而adeN截短的 KL7 菌株在 2022 年显著增加。
2. ATAB 在医院环境中频繁克隆传播：构建基于核心单核苷酸多态性（cgSNP）的系统发育树，发现 ST2^Pas/ST208^Oxf-KL2 谱系构成了最大的 ATAB 分支，广泛分布于多个科室；adeN完整菌株主要由 ST2^Pas/ST208^Oxf-KL7 谱系组成。以 cgSNP 距离为 0 进行聚类分析，ATAB 分离株形成 17 个簇，涉及 35.2%（83/236）的菌株；adeN完整菌株仅形成 3 个遗传簇，涉及 30.7%（23/75）的菌株。在一个簇内，adeN完整菌株 BM8137 演变为 ATAB 菌株 BM8243 和 BM8283，表明adeN截短可在医院环境中发生。
3. ATAB 在全球出现并流行：分析 GenBank 数据库中 18946 个高质量鲍曼不动杆菌基因组，发现 ATAB 分离株在全球广泛分布。导致adeN基因截短的主要插入序列（IS）元件是 ISAba1（93.9%），其次是 ISAba23（2.2%） 。52.6% 的插入发生在adeN基因的 299 - 307 位之间。与本地观察结果一致，IC2 克隆是全球 ATAB 分离株的主要基因型。在与 IC2 相关的 5 种主要荚膜类型（KL2、KL3、KL7、KL9、KL22）中，KL22 主要由adeN完整菌株组成，其他类型则有不同程度的adeN截短。adeN截短的 KL2 菌株全球广泛分布，KL3 菌株在美洲占优势，KL7 菌株主要在亚洲出现。ATAB 菌株最早于 2003 年在欧洲被发现，随后传播到美洲和亚洲。

对浙江省另一家医院 ICU 病房医疗器械表面分离的 432 株菌株分析发现，ATAB 分离株在 ICU 各类表面高度流行（73%，334/432） ，其荚膜类型主要为 KL7（72.2%，241/334），其次是 KL2（21.6%，72/334）。
4. ATAB 与碳青霉烯耐药高度相关：比较 1765 株有完整药敏数据的菌株耐药谱，ATAB 分离株对头孢菌素、碳青霉烯类和喹诺酮类药物的耐药率显著较高，接近或超过 99%（P < 0.001），但对氨基糖苷类药物耐药率较低（P < 0.001）。65% 的 ATAB 分离株表现为多重耐药表型，35% 为广泛耐药。

碳青霉烯耐药主要由碳青霉烯水解 D 类 β - 内酰胺酶（如bla_{OXA - 23}）介导，这些酶通常位于 AbaR 型耐药岛（AbaRs）上，且 AbaRs 主要插入到comM基因中。研究发现，大多数 ATAB 分离株在本地和全球数据集中均表现出comM基因截短，提示adeN截短主要发生在 AbaR 岛整合到comM基因的菌株中。
5. 遗传背景影响 ATAB 对替加环素的耐药性：分析 373 株测序菌株的替加环素最低抑菌浓度（MIC），ATAB 分离株的替加环素 MIC 值普遍较高，范围为 1 - 16 mg/L，MIC₅₀为 4 mg/L。根据欧盟抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准，所有 ATAB 分离株均对替加环素耐药；而根据美国食品药品监督管理局（FDA）标准，仅 11.4%（29/254）的 ATAB 分离株耐药。adeN完整菌株的替加环素 MIC 值分布更广泛，范围为 0.06 - 8 mg/L ，且与菌株荚膜类型相关。adeN完整的 KL7 菌株 MIC 值相对较高，MIC₅₀为 2 mg/L，接近adeN截短的 KL7 菌株（MIC₅₀为 4 mg/L）；其他荚膜类型菌株的替加环素 MIC₅₀为 0.125 mg/L。
6. 感染 ATAB 与患者不良预后相关：选取 61 例从无菌体液中分离出 ATAB 的患者作为研究组，61 例分离出adeN完整菌株的患者作为对照组。两组在性别、年龄分布和 Charlson 合并症指数方面无显著差异。但研究组患者感染前住院时间更长（中位数 42 天 vs 27 天，P < 0.05），ICU 入住率更高（75.4% vs 39.3%，P < 0.001），更易患严重肝脏疾病（29.5% vs 11.5%，P < 0.05）、外周血管疾病（16.4% vs 1.6%，P < 0.01），使用免疫抑制剂的比例更高（16.4% vs 1.6%，P < 0.01），接受气管插管或气管切开的比例更高（73.7% vs 44.3%，P < 0.001）；而adeN完整组实体恶性肿瘤的发生率更高（31.1% vs 11.5%，P < 0.01）。

逻辑回归分析确定 ICU 入住和免疫抑制剂使用是感染 ATAB 的独立危险因素。感染 ATAB 的患者 14 天（29.5%，18/61）和 28 天（32.8%，20/61）死亡率显著高于感染adeN完整菌株的患者（P < 0.01）。 Kaplan - Meier 曲线和对数秩检验显示两组 28 天生存率存在显著差异（P < 0.05）。
7. ATAB 具有更高毒力和较弱生物膜形成能力：随机选取 30 株adeN截短和 30 株adeN完整的鲍曼不动杆菌临床分离株进行实验。结晶紫染色法比较生物膜形成能力，发现adeN截短菌株的生物膜形成能力明显弱于adeN完整菌株。利用大蜡螟幼虫感染模型评估体内致病性，感染adeN截短菌株的大蜡螟幼虫 1 天、4 天和 7 天生存率均低于感染adeN完整菌株的幼虫。

讨论

本研究从本地和全球层面全面探究了adeN截短型鲍曼不动杆菌的基因组流行病学特征。发现该菌株在医院环境中广泛流行，常表现出更严重的耐药特性，与感染患者的不良预后密切相关。adeN截短在指导临床治疗和评估患者预后方面具有潜在价值，同时也揭示了其与全球特定流行谱系的紧密联系，丰富了对其流行动态的认识。

鲍曼不动杆菌 IC2 谱系是全球范围内成功传播的碳青霉烯耐药克隆群，引发了众多医院感染暴发。本研究表明adeN截短主要发生在 IC2 克隆群中，在美洲主要荚膜类型为 KL2 和 KL3，在亚洲为 KL2 和 KL7，且观察到 KL7 型 ATAB 菌株的扩张。有研究显示 KL7 毒力高于其他荚膜类型，在多家医院引发过感染暴发，具有在医院环境中的适应性优势。虽然 ATAB 传播的驱动因素尚不清楚，但消毒剂可能增加adeN失活频率。推测 ATAB 菌株基因型（如荚膜类型）差异可能与当地医院流行谱系频繁暴露于消毒剂选择压力有关。此外，ATAB 在医院内进化并导致多次克隆传播，也可能是其扩张的原因。不过，adeN截短可能因 AdeIJK 外排泵过表达给鲍曼不动杆菌带来适应性负担，限制其在无选择压力环境中的竞争优势，这些因素共同导致了 ATAB 在医院环境中的周期性流行。

研究还发现 ATAB 与特定耐药模式相关，尤其是对头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和替加环素的耐药。虽然 AdeIJK 外排泵对耐药有一定贡献，但基因组中耐药决定因素的差异可能也起着重要作用。对于替加环素耐药，adeN完整的 KL7 谱系本身对替加环素的 MIC 值就较高（MIC₅₀ = 1）。高水平替加环素耐药常与 AdeIJK 外排泵过表达或质粒携带的替加环素灭活酶 TetX 变体有关，染色体基因（如trm、plsC）的特定突变也可能降低菌株对替加环素的敏感性。推测 KL7 型鲍曼不动杆菌菌株中替加环素耐药相关突变的积累使其对替加环素敏感性降低，当发生adeN截短时，就导致菌株出现临床耐药。但对于其他谱系，adeN截短可能不足以诱导临床替加环素耐药，这表明在解读adeN截短与临床替加环素耐药关系时，需考虑菌株的遗传背景。

鲍曼不动杆菌主要感染免疫功能低下的住院患者，感染相关死亡率为 34% - 44.5%。本研究中，感染 ATAB 的患者死亡率显著升高，在大蜡螟幼虫感染模型中也证实了 ATAB 菌株致死性增强。推测死亡率增加可能是多种因素共同作用的结果，包括adeN基因截短导致的毒力增强、复杂的耐药谱可能导致临床治疗失败以及流行的 ATAB 谱系的固有致病性。这些发现强调了adeN截短作为鲍曼不动杆菌感染早期指标，在指导治疗干预和预后评估方面的潜在临床应用价值。

本研究存在一些局限性。作为单中心分析，关于 ATAB 遗传特征和流行率结论的普适性可能受限；无菌部位分离株数量较少，限制了对adeN状态以外因素对患者预后影响的全面评估；区分真正感染和定植存在困难，研究中肺炎诊断常基于临床标准和非无菌部位微生物学结果；此外，选择偏倚和用于 WGS 的adeN完整菌株数量可能影响部分比较的有效性。

总之，本研究突出了 ATAB 作为潜在高风险克隆的广泛存在。鉴于其与耐药性和毒力的关联，早期识别和监测 ATAB 作为医院感染控制的标志物，对于制定有效的管理和治疗策略至关重要。同时，环境消毒剂在驱动 ATAB 出现和传播中的作用也值得深入研究。

材料和方法

1. adeN截短分离株的收集和筛选：在温州医科大学附属第一医院进行回顾性研究，收集 2018 年 1 月至 2022 年 12 月的鲍曼不动杆菌分离株。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF/MS）鉴定菌株，将其保存在 30% 甘油肉汤中，-80°C 储存。通过 PCR 评估adeN基因完整性，若凝胶电泳后 PCR 产物条带比鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 大 800 bp，则表明存在adeN截短（引物序列详见补充表 S3）。
2. 抗菌药物敏感性测试：使用 VITEK2 自动肉汤微量稀释法测定菌株对阿米卡星、头孢他啶、环丙沙星、头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、氨苄西林 / 舒巴坦、复方磺胺甲恶唑和妥布霉素的敏感性；采用手动肉汤微量稀释法测定替加环素敏感性。依据最新临床和实验室标准协会（CLSI）指南解读其他抗菌药物结果，根据 EUCAST 和 FDA 指南解读替加环素敏感性。
3. 全基因组测序、基因组组装和注释：使用 AxyPrep 细菌基因组 DNA 小提试剂盒提取 373 株鲍曼不动杆菌（包括adeN截短和adeN完整菌株）的基因组 DNA。利用 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒构建 DNA 文库，经 Illumina NovaSeq 测序。使用 FastQC 进行原始序列质量控制，fastp 默认参数进行序列修剪。用 SPAdes 组装修剪后的序列，Prokka 进行草图组装注释。使用 pymlst 进行鲍曼不动杆菌多位点序列分型（MLST）分析；Kaptive 确定荚膜（K - 位点）和 O 抗原（O - 型）基因型；AMRFinderPlus 鉴定鲍曼不动杆菌的抗菌药物耐药基因（ARGs）；ISfinder 识别插入到adeN基因的插入序列（IS）元件。
4. 系统发育分析：以医院先前分离的 IC2/ST2 菌株 BM2333 的完整基因组为参考，使用 Snippy 进行基因组核心序列比对。用 Gubbins 去除比对产生的重组位点，SNP - dists 从 Gubbins 过滤后的多态性位点文件计算 SNP 距离。利用 R 语言的 iGRAPH 库提取核心基因组 SNP（cgSNP）距离为 0 的克隆传播簇。
5. GenBank 中鲍曼不动杆菌组装分析：截至 2023 年 6 月，从 GenBank 下载 18946 个已完成和草图阶段的鲍曼不动杆菌基因组组装。从 NCBI 病原体检测数据库检索鲍曼不动杆菌的抗菌药物敏感性测试（AST）表型数据。使用自行编写的 Python 脚本（https://github.com/qcrcherry/comparative_genomic_analysis）检查鲍曼不动杆菌基因组中adeN