攻克耐药难题：靶向肺炎克雷伯菌 ST512 克隆株的噬菌体疗法新突破

抗菌药物耐药性（AMR）问题日益严峻，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）感染治疗困难。本文研发了针对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌 ST512 克隆株的噬菌体疗法医疗产品（PTMPs），为解决耐药问题提供新思路，值得一读。

　　

引言

抗菌药物耐药性（AMR）在全球范围内广泛传播，严重影响抗生素治疗常见感染的效果。多重耐药（MDR）、泛耐药（PDR）和全耐药细菌的快速扩散，使得许多感染难以用传统抗菌药物治疗。目前新抗生素研发停滞，感染死亡率不断上升，若不加以控制，预计到 2050 年每年将导致 1000 万人死亡。

在此背景下，噬菌体疗法作为替代治疗手段受到关注。噬菌体是感染细菌的病毒，宿主范围窄，具有高宿主特异性和低成本等优势。但细菌可能对噬菌体产生耐药性，导致治疗失败。为解决这一问题，可开发噬菌体疗法医疗产品（PTMPs），将多种噬菌体混合以增强对抗 MDR 细菌感染的效果。此外，Appelmans 协议（噬菌体训练）和 PTMPs 与抗生素联合使用也是提高治疗效果的方法。

本研究聚焦于 MDR 细菌肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），尤其是产碳青霉烯酶的 ST512 克隆株。肺炎克雷伯菌是一种常见的机会致病菌，可引发多种感染，近年来其感染爆发的医院数量增多，对其治疗的需求十分迫切。研究旨在开发能靶向临床分离的产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌 ST512 克隆株的适应性 PTMPs。

结果

1. 宿主范围测定：从 22 种裂解性噬菌体中筛选出 4 种宿主范围较广的噬菌体 vB_KpnM-VAC13、vB_KpnP-VAC25、vB_KpnM-VAC36 和 vB_KpnM-VAC66，用于制备两种 PTMPs。其中，CAC_Kpn1 由 VAC13、VAC36 和 VAC66 组成，对菌株 A 有效；CAC_Kpn2 由 VAC25、VAC36 和 VAC66 组成，对菌株 B 和 C 有效。
2. 基因组比较研究：通过比较基因组分析发现，VAC13 和 VAC66 相似度高，VAC13、VAC66 与 VAC36 存在差异，VAC25 与其他三种噬菌体差异显著。VAC13、VAC36 和 VAC66 分别属于Slopekvirus和Marfavirus属，VAC25 属于Drulisvirus属。
3. 噬菌体种子的电子显微镜分析：透射电镜（TEM）分析显示，VAC13、VAC36 和 VAC66 具有典型的肌尾噬菌体形态，VAC25 具有典型的短尾噬菌体形态。
4. 噬菌体溶原性感染能力筛选：通过 PCR 检测特定基因，结果表明 VAC13、VAC25、VAC36 和 VAC66 均为严格裂解性噬菌体，不会插入菌株 A、B 和 C 的细菌基因组。
5. 液体培养基中的感染性测定：在液体培养基中进行感染性测定，结果显示 VAC13、VAC36 和 VAC66 对菌株 A 感染性高，VAC36 和 VAC66 最为显著；对菌株 B 和 C，VAC36 和 VAC66 感染较弱且后期出现耐药性。PTMP CAC_Kpn1 可使菌株 A 的细菌生长在 7 小时内完全抑制，但 7 小时后出现耐药；PTMP CAC_Kpn2 对菌株 B 和 C 的 CFU/mL 计数在 12 小时后显著增加，表明效果不佳。
6. 噬菌体训练：PTMPs 的适应及适应性 PTMPs 组成的确定：根据 CAC_Kpn1 和 CAC_Kpn2 在液体测试中的结果，采用 Appelmans 协议对其进行适应，以提高治疗效果并降低耐药性。定量 PCR（qPCR）分析显示，VAC36 在各适应性 PTMPs 中比例较高。适应后的 CAC_Kpn1_ad 对菌株 A 的感染性显著提高，22 小时内疗效达 100%；而 CAC_Kpn2_ad 的效果不太理想，CFU/mL 和 PFU/mL 计数随时间增加。因此，进一步试验将 β- 内酰胺抗生素美罗培南加入适应性 PTMPs 中。
7. 美罗培南最小抑菌浓度测定及含 1/2 MIC 美罗培南的液体培养基感染性测定：通过微量肉汤稀释法测定美罗培南对菌株 B 和 C 的最小抑菌浓度（MIC），分别为 16mg/L 和 8mg/L。将 1/2 MIC 美罗培南与 CAC_Kpn2_ad 联合进行液体感染性测试，结果显示对菌株 B 和 C 的疗效显著提高，20 小时内对菌株 B、22 小时内对菌株 C 的疗效达 100%，且 CFU/mL 计数在 12 小时显著下降，表明产生了噬菌体 - 抗生素协同作用（PAS）。
8. 细菌突变体出现率的测定：测定噬菌体耐药突变细菌细胞的出现率，结果显示菌株 A 在使用 CAC_Kpn1_ad 时突变率显著低于其他两种 PTMPs；菌株 B 中，PTMP 与抗生素联合使用的效果优于单一疗法，表现出协同作用；菌株 C 中，CAC_Kpn2_ad 与 1/2 MIC 美罗培南联合使用的突变率与 1/2 MIC 美罗培南单独使用时无显著差异。
9. 内毒素的纯化和定量：内毒素去除是噬菌体疗法的关键步骤，因为它可能引发患者过敏反应。使用 Endrotrap HD 去除内毒素后，对适应性 PTMPs 进行定量。结果显示，CAC_Kpn1_ad 浓度为 3.3×10⁸ PFU/mL，靶向菌株 B 的 CAC_Kpn2_ad 浓度为 1.5×10⁷ PFU/mL，靶向菌株 C 的 CAC_Kpn2_ad 浓度为 1.36×10⁷ PFU/mL。使用 Pierce Chromatogenic Endotoxin Quant Kit 对各 PTMPs 的内毒素浓度进行定量，结果分别为 0.33 EU/mL、0.58 EU/mL 和 0.81 EU/mL。
10. 大蜡螟（G. mellonella）感染模型：确定大蜡螟幼虫感染的最佳肺炎克雷伯菌接种浓度为 10⁹ CFU/mL。幼虫存活试验显示，CAC_Kpn1_ad 在 24 小时内对菌株 A 感染的幼虫有显著保护作用；而 CAC_Kpn2_ad 对菌株 B 和 C 感染的幼虫保护作用不显著。适应性 PTMPs 和美罗培南单独使用对幼虫均无毒性作用。

讨论

抗菌药物耐药性的增加促使人们关注噬菌体等替代抗菌治疗方法。本研究设计了两种 PTMPs（CAC_Kpn1 和 CAC_Kpn2），旨在靶向高风险的肺炎克雷伯菌 ST512 菌株，提高了噬菌体对肺炎克雷伯菌的治疗效果。

值得注意的是，使用 Appelmans 协议的 CAC_Kpn1 和 CAC_Kpn1_ad 未出现耐药性，完全抑制了细菌生长。而 CAC_Kpn2_ad 虽比单个噬菌体疗效有所提高，但仍未完全消除细菌生长，且出现耐药性。因此，将 β- 内酰胺美罗培南（1/2 MIC）与 CAC_Kpn2_ad 联合使用，有效降低了耐药性，在菌株 B 和 C 中分别在 20 小时和 24 小时内抑制了细菌生长，产生了 PAS。这种现象在其他研究中也有观察到，如美罗培南与环丙沙星联合、PTMPs 与抗生素联合治疗不同细菌感染等。

此外，研究还测定了突变频率。菌株 A 在 CAC_Kpn1_ad 作用下突变频率极低，符合多噬菌体联合治疗的预期；而 CAC_Kpn2_ad 的突变频率较高，联合抗生素后显著降低，但菌株 C 中联合治疗与美罗培南单独使用的突变频率无显著差异，这一结果令人意外。

在研究 PTMPs 的杀菌能力后，去除内毒素并在大蜡螟感染模型中进行体内试验。该模型中细菌接种物的 LD₅₀为 10⁹ CFUs/mL，高于其他研究，可能与菌株适应性低有关。结果显示，CAC_Kpn1_ad 可提高菌株 A 感染幼虫的 24 小时存活率，而 CAC_Kpn2_ad 联合 1/2 MIC 美罗培南的效果与单独使用 PTMPs、1/2 MIC 美罗培南或联合使用时无显著差异。其他研究也报道了 PTMPs 在体内试验中的成功案例，如提高幼虫存活率等。

结论

综上所述，制备 CAC_Kpn1 和 CAC_Kpn2 PTMPs 及其适应性产品（CAC_Kpn1_ad 和 CAC_Kpn2_ad），以及 CAC_Kpn2_ad 与 β- 内酰胺抗生素的 PAS，为解决部分抗菌药物耐药问题提供了有效途径，有望推动噬菌体疗法作为个性化医疗的应用。大蜡螟模型验证了体外试验结果，对开发针对肺炎克雷伯菌 MDR 临床菌株的 PTMPs 具有重要意义。

材料和方法

1. 体外试验：体外试验流程包括菌株收集研究、噬菌体分离与鉴定、宿主范围测定、透射电镜分析、感染曲线测定、Appelmans 方法应用、美罗培南 MIC 测定、内毒素纯化和突变频率测定等。
2. 细菌菌株：研究使用了 47 株先前鉴定的肺炎克雷伯菌临床分离株，以及 3 株产 KPC-3 碳青霉烯酶的高风险 ST512 克隆临床菌株 A、B 和 C。这些菌株来自不同西班牙地理区域，通过核心基因组多位点序列分型（cgMLST）确定其遗传距离大于 20 个等位基因。
3. 噬菌体种子的分离、纯化、繁殖和测序：使用来自西班牙精准医学抗耐药项目（MePRAM）收集的 22 种裂解性噬菌体制备 PTMPs，其分离、纯化、繁殖、鉴定和测序过程已在先前研究中描述，所有基因组可在 GenBank 数据库中获取。
4. 宿主范围测定：采用斑点试验技术测定噬菌体宿主范围，以 SM 缓冲液为阴性对照，根据平板上是否出现清晰斑点、浑浊斑点或无斑点判断噬菌体感染性，所有测定均重复三次。
5. 基因组比较研究：选择用于制备 PTMPs 的噬菌体种子后，使用 VipTree 服务器进行比较基因组分析。
6. 噬菌体种子的电子显微镜分析：对用于制备 PTMPs 的 4 种裂解性噬菌体种子用 1% 醋酸铀水溶液进行负染色，然后用透射电镜（JEOL JEM-1011）进行分析。
7. 噬菌体溶原性感染能力筛选：通过感染不同菌株（A、B 和 C），在细菌培养至 OD 为 0.3 时加入噬菌体 PTMPs，2.5 - 3 小时后离心、洗涤，分离培养并选取 10 个菌落进行 PCR，检测特定噬菌体基因是否整合到基因组中，以确定噬菌体的溶原性感染能力。实验重复三次。
8. 液体培养基中的感染性测定：在液体培养基中通过测量 600nm 波长处的吸光度（OD_600nm），每 15 分钟测量一次，持续 22 小时，同时测定 12 小时和 22 小时的 CFU/mL 和 PFU/mL 数量，以评估噬菌体感染性。实验使用斑点试验筛选出的噬菌体种子、未适应和适应的 PTMPs 进行，对于 CAC_Kpn2_ad 还进行了添加 1/2 MIC 美罗培南的实验。所有实验重复三次。
9. Appelmans 协议：采用 Appelmans 协议对制备的 PTMPs（CAC_Kpn1 和 CAC_Kpn2）进行适应。在 96 孔微量滴定板中进行操作，将 PTMPs、LB 肉汤和细菌混合孵育，观察裂解情况，收集裂解液进行后续处理，适应过程最长持续 5 天。
10. PTMPs 中噬菌体种子数量的测定：使用 iTaq Universal SYBR Green One-step Kit 进行 qPCR，对每种噬菌体种子的特定基因进行扩增，以定量 PTMPs 的组成，引物设计用于获得 150bp 的扩增产物。
11. 美罗培南最小抑菌浓度测定：通过微量肉汤稀释法测定美罗培南对肺炎克雷伯菌临床菌株 B 和 C 的 MIC。在 96 孔微量滴定板中制备美罗培南的系列双倍稀释液，接种相应菌株，同时设置阳性和阴性对照，孵育 24 小时后观察细菌生长情况，确定 MIC。实验重复三次。
12. 噬菌体耐药细菌突变体出现率的测定：采用 Merabishvili 等人描述的方法检测噬菌体耐药突变细菌细胞的出现频率。将细菌培养物与噬菌体肉汤接触，接种到 TA 平板上培养，同时设置对照平板，计算突变细胞频率。对于抗生素 - 噬菌体联合治疗，在培养基中添加 1/2 MIC 抗生素后进行同样操作。
13. 内毒素的纯化：使用 EndoTrapHD 亲和层析柱纯化内毒素，根据试剂盒说明，将适应性 PTMPs 稀释后进行内毒素去除，该试剂盒可高效去除多种生物分子中的内毒素。
14. 内毒素的定量：使用 Pierce Chromatogenic Endotoxin Quant Kit 对适应性 PTMPs 中的内毒素进行定量，该试剂盒基于变形细胞溶解物测定法，可检测低至 0.01 EU/mL 的内毒素，同时使用双层琼脂法对 PTMPs 进行定量，以计算实际的 PFU/mL 数量。
15. 体内试验：体内试验采用大蜡螟模型，流程包括接种物制备、使用不同处理（PTMPs 注射、美罗培南注射和对照组）处理大蜡螟，以及数据分析。
16. 大蜡螟感染模型：大蜡螟模型参考了 Peleg 等人和 Blasco 等人开发的版本。选取 15 只大蜡螟幼虫，通过注射 10⁹ CFU/mL 的适应性 PTMPs 进行感染，注射剂量根据 50% 致死剂量（LD₅₀）确定。感染 1 小时后，幼虫接受不同处理，包括 PTMP（CAC_Kpn1_ad 或 CAC_Kpn2_ad）、美罗培南（1/2 MIC）、CAC_Kpn2_ad 加美罗培南（1/2 MIC）或作为对照的适应性 PTMPs 和美罗培南。所有处理浓度与体外试验相同，设置感染幼虫注射 PBS 的对照组。处理后的幼虫置于培养皿中，在黑暗中 37°C 孵育，24 小时后记录死亡幼虫数量，以幼虫对触摸无反应判断为死亡。使用 GraphPad Prism v.6 绘制生存曲线，采用 Mantel-cox 检验进行数据分析。所有实验重复三次。

致谢

本研究得到了多项资助，包括 PI19/00878 和 PI22/00323 等项目资助。多位研究人员参与了实验、撰写、审核等工作，共同推动了研究的进行。