嗜酸氧化亚铁硫杆菌外膜赋予其对稀土元素的高耐受性：开启生物冶金新征程

稀土元素（REEs）在科技领域至关重要，需求与日俱增。本文研究发现嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）对高浓度 REEs 耐受性强，其外膜起关键作用。这一成果为 REEs 生物提取技术发展提供支撑，极具应用潜力。

　　

引言

极端微生物独特的生理特性使其能在多数生物难以生存的极端环境中存活。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）是一种极端嗜酸菌，常用于硫化矿的氧化还原浸出，对多种重金属有抗性，在生物修复、电子废物回收及非硫化矿金属提取等领域也有应用。近年来，其在稀土元素（REEs）浸出和回收方面的研究备受关注。

REEs 是一组具有重要技术价值的金属，包括镧系元素、钇和钪。随着需求的增长，其提取和纯化技术不断创新，生物法提取 REEs 成为研究热点。虽然 REEs 对动物和嗜温微生物有毒性，但在一些甲基营养菌的醇脱氢酶中起辅助因子作用。目前，关于极端微生物对 REEs 耐受性的研究较少，且缺乏机制性见解。

已有研究表明，REEs 对大肠杆菌（Escherichia coli）的膜损伤会导致细胞毒性，但 REEs 对生物浸出微生物的影响尚未见报道。本研究旨在揭示嗜酸氧化亚铁硫杆菌对高浓度 REEs 的响应机制，并对比其与大肠杆菌对 REEs 的差异反应，为 REEs 生物浸出工艺开发和生物技术应用提供理论依据。

结果

1. 大肠杆菌对 REEs 高度敏感：通过在贫磷基本培养基中培养大肠杆菌 BL21 (DE3)，测定不同 REEs 浓度下的生长曲线，计算出半最大抑制浓度（IC₅₀）。结果显示，REEs 抑制大肠杆菌生长，IC₅₀值在 < 10 μM 至～200 μM 之间，不同 REEs 的抑制效果存在差异。与文献报道相比，本研究中大肠杆菌对 REEs 的敏感性稍低，可能是菌株差异所致。
2. 嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长不受饱和 REEs 抑制：以亚铁或元素硫为能源，培养嗜酸氧化亚铁硫杆菌，添加不同浓度的 REEs。结果表明，高达 5 mM 的 REEs 对其生长速率和最终细胞数量无显著影响，即使在 100 mM Ho³⁺、Ce³⁺或 50 mM Nd³⁺存在下，嗜酸氧化亚铁硫杆菌仍能正常氧化亚铁，且初始生长速率不受影响。这表明嗜酸氧化亚铁硫杆菌对高浓度 REEs 具有极高的耐受性。
3. 大肠杆菌对 REEs 有独特且可逆的生理反应：高浓度 REEs（300 μM 和 1 mM）会使大肠杆菌 BL21 (DE3) 形成细胞团块，沉降在孔底部，导致光密度（OD₆₀₀）测量不准确。显微镜观察发现，1 mM TbCl₃处理 2 小时后，大肠杆菌形成大的细胞团块，加入乙二胺四乙酸（EDTA）后团块立即破碎。生长曲线实验表明，EDTA 可逆转 REEs 介导的生长抑制，但细胞最终密度仍低于未暴露于 REEs 的细胞，说明 EDTA 也会对细胞生长产生一定抑制作用。
4. 嗜酸氧化亚铁硫杆菌不受 REEs 生理影响：通过光学显微镜观察，在 pH 2 和 pH 7.4 条件下，嗜酸氧化亚铁硫杆菌暴露于 REEs 后均未出现絮凝现象，表明其细胞膜具有抵抗 REEs 的特性，可能与其外膜结构有关。
5. REEs 定量损伤大肠杆菌膜质量：利用荧光探针检测脂质过氧化和膜通透性，结果显示，钕（Nd）和铽（Tb）处理显著增加了大肠杆菌的脂质过氧化和膜通透性。而嗜酸氧化亚铁硫杆菌在 1 mM Nd³⁺或 1 mM Tb³⁺处理下，脂质过氧化和膜通透性无显著变化，且其基础水平低于大肠杆菌，表明嗜酸氧化亚铁硫杆菌对 REEs 等氧化剂具有固有抗性。
6. 嗜酸氧化亚铁硫杆菌外膜是耐受 REEs 的必要条件：嗜酸氧化亚铁硫杆菌的许多适应极端环境的特性与其细胞表面有关，其膜中含有较多的环丙基脂质，与应激反应相关。制备嗜酸氧化亚铁硫杆菌和大肠杆菌的原生质球，去除外膜和细胞壁后，嗜酸氧化亚铁硫杆菌对 REEs 变得敏感，脂质氧化和膜通透性增加，而大肠杆菌原生质球的脂质过氧化虽高，但 REEs 对其影响不显著。这表明嗜酸氧化亚铁硫杆菌完整的细胞表面对其耐受 REEs 至关重要。

讨论

本研究提出了一个模型来解释大肠杆菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌对高浓度 REEs 的差异反应。大肠杆菌的细胞膜在 REEs 作用下会发生脂质过氧化和膜损伤，导致细胞死亡；而嗜酸氧化亚铁硫杆菌只有在完整外膜的保护下才能抵抗 REEs 介导的损伤。光学显微镜观察、荧光探针分析及原生质球实验均支持这一模型，表明嗜酸氧化亚铁硫杆菌的 REE 耐受性源于其细胞表面结构。

极端微生物常对其栖息地外的极端条件表现出耐受性，嗜酸氧化亚铁硫杆菌对饱和 REEs 浓度的耐受性使其成为工业 REE 生物处理的理想底盘生物。随着对绿色处理需求的增加，能够在极端条件下生长的生物底盘将发挥重要作用，嗜酸氧化亚铁硫杆菌有望在 REE 分离技术中得到广泛应用。

材料和方法

1. 材料：实验所用化学品大多购自 Sigma-Aldrich，部分特殊试剂购自其他公司。实验菌株大肠杆菌 BL21 (DE3) 购自 New England Biolabs，嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株 23270 购自 American Type Culture Collection。
2. 细胞培养：大肠杆菌常规培养于 LB 培养基，37°C、150 rpm 振荡培养。用于 REEs 生长曲线实验的贫磷基本培养基参照文献配制，pH 调至 6.4。嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养基含有 AF 基础盐，根据不同实验需求添加硫或亚铁，pH 调整合适值，30°C、100 rpm 振荡培养。
3. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 生长曲线测定：制备 REEs 储备液，稀释后加入到调整好浓度的大肠杆菌悬液中，在 96 孔板中培养，37°C 振荡，每隔 15 分钟测定 OD₆₀₀，共 8 小时。对于 EDTA 处理的生长曲线，在培养 2 小时后加入 5 mM EDTA，继续培养 6 小时。
4. 嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长曲线测定：制备嗜酸氧化亚铁硫杆菌的 REEs 储备液，使用硫酸盐形式。以 1% 体积比接种到含不同浓度 REEs 的培养基中，根据生长底物不同，定时取样，利用 SYBR Green 荧光法测定细胞密度，并换算成 OD₆₀₀。
5. 饱和 REEs 条件下铁氧化的测量：将嗜酸氧化亚铁硫杆菌接种到含特定浓度 Fe₂SO₄和 REEs 的溶液中，30°C、150 RPM 培养，通过铈量法滴定测定 Fe²⁺向 Fe³⁺的转化。
6. 显微镜观察：分别培养大肠杆菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌，处理后制成玻片，在 1000× 放大倍数下观察细胞形态。添加 EDTA 观察其对细胞絮凝的影响，并用软件处理图像。
7. 完整细胞的荧光测定：制备 NBD-PEN、DiBAC₄(3) 和碘化丙啶的工作液，处理培养好的大肠杆菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞，孵育后测定荧光强度，分别检测脂质过氧化和膜通透性。
8. 原生质球的荧光测定：按照文献方法制备原生质球，处理后添加荧光探针，测定荧光强度。
9. 统计分析：定量测量均进行三次重复，结果以平均值 ± 标准差表示。使用 MATLAB 2024a 拟合生长曲线计算 IC₅₀值，用 Student’s 两尾 t 检验计算 P 值，α = 0.05。