激活的人源血液T细胞支持HAdV-C5病毒复制及向极化上皮细胞的传播机制研究

这篇研究通过设计三聚体适配蛋白（DARPin）将HAdV-C5重定向至CD3/CD28/IL-2R，首次实现原代T细胞的体外高效感染，并建立T细胞-支气管上皮细胞共培养模型，揭示免疫缺陷患者中腺病毒从淋巴组织向呼吸道传播的潜在机制，为持续性感染研究提供新平台。

　　

ABSTRACT

人类腺病毒（HAdV）在免疫功能低下个体中可引发致命感染。研究聚焦HAdV-C5，通过工程化改造的三聚体适配蛋白（含抗CD3/CD28单链抗体及IL-2的DARPin复合物）突破T细胞感染壁垒。这些适配体通过结合病毒纤维 knob 和T细胞表面受体，实现原代T细胞高达36%的感染效率，且具有供体间差异性。

INTRODUCTION

病毒持续感染机制是研究热点。HAdV-C5能在胃肠道淋巴组织中长期潜伏，免疫抑制时重新激活。既往研究受限于原代T细胞难以感染的问题，因缺乏高亲和力受体CAR。本研究创新性采用三聚体适配蛋白策略，模拟免疫突触环境，为揭示病毒传播机制提供工具。

RESULTS

三适配体策略激活T细胞感染

实验采用三种HAdV-C5报告病毒：

1. 复制型HAdV-C5-E1A-2A-GFP（通过核糖体跳过表达E1A和GFP）
2. 复制缺陷型HAdV-C5-ΔE1-CMV-GFP
3. GFP-E4orf4融合病毒

流式细胞术显示，适配体包裹的病毒在6例供体T细胞中实现15%-36%感染率。其中ΔE1-CMV-GFP因CMV强启动子效率最高，而E1A-2A-GFP因天然启动子活性较低。

病毒复制与子代释放

qPCR检测显示，感染后2天病毒DNA复制达峰值（供体8增加20倍，供体9增加11倍），显著低于A549细胞的1000倍增幅。子代病毒释放持续至12天，但每个感染细胞仅产生<100感染单位，提示低水平复制可能利于细胞存活。

上皮细胞传播模型

将感染T细胞与气液界面（ALI）培养的人支气管上皮细胞共培养：

• 顶端接种：子代病毒7天达峰值（类似游离病毒感染动力学）
• 基底侧接种：延迟至15天达峰
  免疫荧光证实GFP⁺上皮细胞出现，且仅复制型病毒能传播，说明T细胞作为"病毒储存库"可重新感染上皮细胞。

DISCUSSION

该研究突破性发现包括：

1. DARPin适配体克服CAR限制，实现原代T细胞感染
2. 低水平复制符合临床观察的持续性感染特征
3. 共培养模型再现免疫抑制患者的病毒传播路径

局限性在于依赖工程化适配体，且未解析病毒表观遗传沉默机制。未来可结合CRISPR筛选技术，探索T细胞中限制病毒复制的宿主因子。

MATERIALS AND METHODS

关键技术细节：

• 病毒制备：CsCl梯度纯化HAdV-C5-IX-2A-GFP等毒株
• T细胞激活：CD3/CD28抗体磁珠+IL-2（200 U/mL）刺激24小时
• ALI培养：人支气管上皮细胞经4-6周分化形成纤毛 beating 的极化层
• 检测方法：
  • 流式：BD FACSymphony A5分析GFP⁺细胞
  • qPCR：E1A启动子引物（灵敏度达10拷贝/反应）
  • 子代滴定：HeLa细胞中计数蛋白VI⁺病灶

该模型为研究粘膜免疫-上皮互作开辟新途径，尤其对造血干细胞移植后腺病毒再激活的干预策略开发具有重要价值。