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本文聚焦流感疫苗研究，开发出编码流感 B 病毒（IBV）神经氨酸酶（NA）与 A 病毒 M2 外膜区（M2e）结合的 mRNA 疫苗。研究发现，高剂量该疫苗可提供交叉保护，低剂量与灭活裂解疫苗联用能增强免疫反应和交叉保护效力，为疫苗策略创新提供依据。
引言
季节性流感疫苗多为灭活裂解疫苗，主要针对血凝素（HA）产生菌株特异性中和免疫。然而，由于循环毒株中 HA 受体结合位点的突变，其总体有效性较低，仅为 10%-60%。神经氨酸酶（NA）作为流感病毒的第二大表面蛋白，被视为诱导交叉保护性免疫的潜在靶点，且独立于 HA 头部抗体发挥作用。流感 A 病毒 M2 离子通道蛋白外膜区（M2e）可提供广泛交叉保护抗原，但效力相对较弱。此前研究表明，展示多亚型共识 NA 和 5xM2e 重复蛋白的病毒样颗粒（VLP）疫苗，在小鼠和雪貂中能对 A、B 型流感病毒产生广泛保护。不过，这类疫苗因非中和免疫，有效性受限，且在生产、纯化和稳定性方面存在问题。
COVID-19 mRNA 疫苗的成功，引发了对新型 mRNA 疫苗策略的关注。在流感疫苗研究中，给小鼠接种 H1 HA mRNA，可诱导同源保护，但体重减轻程度与剂量相关；多亚型 HA mRNA 疫苗即便高剂量使用，在小鼠面对异源病毒攻击时，仍有显著体重减轻现象。而多抗原靶向 mRNA 疫苗或五价 mRNA 疫苗联合使用，可增强同源和异源保护。脂质纳米颗粒（LNP）作为 mRNA 疫苗载体，高剂量使用时具有炎症性，但这种炎症性在一定程度上对重组 HA 蛋白共接种有佐剂效应。目前，低剂量 mRNA LNP 疫苗的免疫增强作用尚不明确。
在本研究中，设计了一种新的交叉保护性 mRNA 构建体，编码与 4xM2e 串联重复结合的流感 B 病毒（IBV）NA（NA mRNA）。研究假设低剂量 NA mRNA 与灭活裂解疫苗联合使用，相比单独使用低剂量 mRNA 或裂解疫苗，能增强免疫反应和交叉保护效力。
结果
- 流感 B 病毒嵌合 NA mRNA 疫苗的构建：构建的 IBV NA mRNA 疫苗编码一种嵌合 NA，包含信号肽 tPA、4xM2e（hM2e–sM2e–a1M2e–a2M2e）、四聚体稳定结构域以及与全长 84 - 471 位氨基酸的 NA 胞外区相连。对嵌合 B NA mRNA 序列进行密码子优化，提高 G/C 含量并减少尿苷核苷。通过体外转录制备 NA mRNA 疫苗，用 N1 - 甲基假尿苷替换尿苷。转染 HEK 293T 细胞后，利用细胞表面酶联免疫吸附测定（ELISA）和荧光显微镜，证实了 B NA mRNA 的表达。
- 流感 B 病毒嵌合 NA mRNA（3μg 剂量）疫苗诱导交叉反应性 IgG 抗体并提供广泛交叉保护：将嵌合 B NA mRNA 封装到 LNP 中，用于小鼠体内接种，研究其免疫原性和功效。初次接种 3μg NA mRNA 后，诱导产生低水平针对 IBV（B/Florida）NA 的 IgG 抗体。加强接种后，NA 特异性 IgG 滴度显著增加，针对不同谱系菌株的病毒抗原的 IgG 滴度也明显升高，且比 1μg NA mRNA 组高 2 - 3 个 log10 倍。同时，诱导产生高水平针对 M2e 的 IgG 抗体。3μg NA mRNA 加强接种的血清，对不同谱系 IBV 的神经氨酸酶抑制（NAI）滴度较高，而 1μg 剂量组的 NAI 活性滴度较低。
用致死剂量的不同谱系 IBV 攻击接种和对照小鼠，3μg NA mRNA 加强接种的小鼠对多种病毒表现出良好保护，体重损失小且存活率达 100%；1μg 组虽能提供生存保护，但体重损失较大；对照 mRNA（C - mRNA）组则无法抵御 IBV 攻击。此外，该疫苗诱导的抗血清对流感 A 病毒也有一定保护作用。
3. 低剂量（1μg）mRNA - LNP 与裂解疫苗联合使用显著提高交叉谱系结合 IgG 滴度：研究低剂量 NA mRNA - LNP 与 IBV 裂解疫苗联合使用，对体液免疫反应的影响。结果显示，联合组（NA mRNA + sFL、C - mRNA + sFL）在初次接种后，针对 B/Flo 的 NA 的 IgG 滴度显著高于单独使用 sFL 或 NA mRNA 组。加强接种后，NA mRNA + sFL 组针对多种菌株的 NA 的 IgG 滴度最高，比 C - mRNA + sFL 组高约 10 倍。同时，联合组针对 IBV 抗原的 IgG 滴度也显著高于 sFL 单独组，且 NA mRNA + sFL 组在加强接种后，能诱导产生中等水平针对 M2e 的 IgG 抗体。
4. 低剂量（1μg）mRNA - LNP 与裂解疫苗联合使用显著增强功能性交叉反应性神经氨酸酶和血凝抑制活性：在功能性抗体诱导方面，NA mRNA + sFL 加强接种的抗血清，对多种 IBV 的 NAI 活性最高，C - mRNA + sFL 组次之，sFL 和 NA mRNA 单独组最低。NA mRNA + sFL 组初次接种的抗血清，针对 B/Florida 的血凝抑制（HAI）活性最高，加强接种后，各疫苗组针对 B/Florida 的 HAI 活性均有增加。NA mRNA + sFL 和 C - mRNA + sFL 组加强接种的血清，针对同源谱系病毒的交叉 HAI 活性高于 sFL 疫苗组，但所有疫苗组针对交叉谱系 B/Malaysia（V）病毒的 HAI 活性均未检测到。
体内实验表明，用 NA mRNA + sFL 或 C - mRNA + sFL 血清与病毒共接种的小鼠，对 B/Florida 病毒的保护效果优于 sFL 单独组和 NA mRNA 1μg 单独组。
5. 联合 NA mRNA 与裂解疫苗可有效提供针对 IBV 的同源和交叉谱系保护，并清除肺病毒载量：sFL 单独（0.3μg）、C - mRNA + sFL 和 NA mRNA + sFL 加强接种组，均能为小鼠提供同源保护，但 NA mRNA（1μg）接种的小鼠仍有一定体重损失。NA mRNA + sFL 初次接种的抗血清，对同源 B/Florida/4/2006 病毒的保护效果优于 sFL 单独和 C - mRNA + sFL 初次接种血清。NA mRNA + sFL 接种还能提供针对 B/Malaysia/2004（V）病毒的交叉谱系保护，且在感染后第 5 天，该组小鼠的肺病毒载量比其他组显著降低。
6. NA mRNA 与 sFL 联合接种诱导有效保护，抑制感染后肺部炎症反应：感染 B/Malaysia/2004 的未免疫小鼠，肺部炎症趋化因子、细胞因子和细胞浸润水平最高。NA mRNA + sFL 组在清除病毒载量的同时，能有效抑制肺部多种炎症因子的产生，包括单核细胞趋化蛋白 - 1（MCP - 1/CCL2）、KC/CXCL - 1、IP - 10/CXCL - 10、TNF - a、IL - 6 和 IL - 1β。同时，该组能有效抑制多种炎症细胞向肺部浸润，使肺部常驻 CD11b+ rDCs 和肺泡巨噬细胞（AMs）水平高于 sFL 和对照组。
7. NA mRNA 与 sFL 联合接种有效诱导淋巴和肺组织中的 B 细胞和 T 细胞反应：感染 B/Malaysia/2004 后第 5 天，检测细胞免疫反应。NA mRNA（1μg） + sFL 组在脾脏中的生发中心（GC）B 细胞、记忆 B 细胞和浆细胞水平最高。该组和 NA mRNA（1μg）组的脾脏 T 滤泡辅助细胞（Tfh）和效应记忆 CD4+、CD8+ TEM细胞数量，相比 sFL 组有适度增加。
在肺部和纵隔淋巴结（mLN）中，NA mRNA + sFL 组经体外刺激后，产生的 IFN - γ+ CD8 T、IFN - γ+ CD4 T、IL - 4+ CD8 T 和 IL - 4+ CD4 T 细胞水平最高。
8. NA mRNA 启动及剂量对增强维多利亚谱系 sML 疫苗免疫原性的影响：用维多利亚谱系裂解疫苗（sML）单独或与 1μg NA mRNA 联合启动小鼠免疫。结果显示，NA mRNA（1μg） + sML（0.15μg）组在启动后，针对 NA 和 IBV 抗原的 IgG 抗体滴度比 sML 单独组高约 10 倍。在加强接种时，不同剂量 NA mRNA 与 sML 联合使用，1 - 3μg mRNA + sML 组针对 NA 的 IgG 滴度最高，且该组针对交叉谱系 IBV 抗原的 IgG 滴度也显著高于其他组，同时诱导产生的 M2e 特异性 IgG 滴度也更高。
9. 在启动和加强联合疫苗中包含 NA mRNA 对增强功能性抗体和交叉谱系保护至关重要：NA mRNA（1μg） + sML 启动组，针对 B/Malaysia/2506/2004（V）的 HAI 滴度比 sML 启动组高 2 倍。加强接种后，1 - 3μg mRNA + sML 组针对同源和异源病毒的 HAI 滴度显著增加，且高于其他组。该组针对同源和交叉谱系病毒的 NAI 活性也显著高于其他组。
用 B/NY/17（Y）病毒攻击小鼠后，1 - 3μg mRNA + sML 和 1 - 1μg mRNA + sML 组体重损失最小，存活率最高，表明在启动和加强剂量中包含 NA mRNA，对提高交叉谱系 NAI 活性和 IBV 保护作用显著。
讨论
NA 是流感病毒的重要糖蛋白，比 HA 变异小。针对 M2e 和 NA 的免疫，有助于拓宽对流感的交叉保护。本研究设计的 NA mRNA 疫苗，在 3μg 剂量时可诱导产生针对不同 IBV NA、病毒抗原及多种 M2e 表位的交叉反应性 IgG 抗体，并诱导针对不同谱系 IBV 的功能性 NAI 活性。NAI 活性与对 B/Florida（Y）的保护相关，可防止体重减轻。虽然部分 IBV 与 NA mRNA 疫苗的 NA 氨基酸同源性较高，但 NAI 活性并不完全与之相关。
此前研究多使用高剂量（5 - 50μg）mRNA 疫苗，但考虑到 LNP 载体的炎症性，高剂量 mRNA LNP 疫苗在人体中可能产生不良副作用。低剂量（1μg）NA mRNA 在诱导 NA 和 IBV 抗原的 IgG 以及 NAI 活性方面效果较差，对 B/Florida（Y）的保护效力不如 sFL（0.3μg），但仍能诱导低水平 NA 特异性 IgG，并对 B/Malaysia（V）提供生存保护，这可能与抗原特异性 T 细胞反应有关。
本研究证实，低剂量 NA mRNA 与裂解疫苗联合使用，可增强 NA 特异性 IgG 抗体水平和交叉谱系 NAI 滴度，提供比单独使用疫苗更强的交叉谱系保护。NA mRNA 疫苗在提供交叉反应性 NA 免疫的生存保护，以及增强联合裂解疫苗的交叉谱系保护方面，具有双重作用。
流感病毒感染小鼠会导致肺部炎症，而 NA mRNA + sFL 接种可清除肺病毒载量，抑制肺部炎症反应，这与肺部常驻 rDCs 和 AMs 的增加有关。同时，联合接种诱导的细胞免疫反应，包括 T 细胞和 B 细胞反应，可能有助于增强交叉谱系保护。低剂量 NA mRNA 疫苗有望减少炎症反应，提供更安全的接种方式，但不同疫苗对先天免疫的调节机制仍需进一步研究。总之，低剂量 NA mRNA 与裂解疫苗联合使用，具有免疫学优势，为克服单一疫苗平台的局限性提供了新策略。
材料和方法
- 病毒、mRNA 和裂解疫苗：使用多种活病毒进行病毒攻击实验，包括 Yamagata（Y）谱系的 B/Florida/4/2006 等，以及 Victoria（V）谱系的 B/Malaysia/2506/2004 等。对 NA mRNA 疫苗基因进行密码子优化，通过体外转录制备，并进行纯化。同时制备 SARS - CoV - 2 刺突外膜区编码 mRNA 作为对照 mRNA（C - mRNA），以及购买增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA。使用 1% 福尔马林灭活和 Triton X - 100 处理制备灭活裂解疫苗，并通过血凝活性单位（HAU）测定评估其质量。
- 细胞转染和试剂：培养 HEK 293T 细胞和 Madin - Darby 犬肾（MDCK）细胞，使用 Lipofectamine 2000 转染试剂将 mRNA 转染到 HEK 293T 细胞中。获取 IBV NA 蛋白，用于后续实验。
- mRNA 用 LNP 封装：使用商业可得的优化 LNP 混合物（GenVoy - ILM），通过 NanoAssemblr Benchtop Instrument 将 mRNA 封装到 LNP 中，并用 RoboGreen 测定法测定封装后 mRNA 的含量。
- 免疫荧光测定和 IgG 细胞 ELISA：对转染后的 HEK 293T 细胞进行固定、封闭，与抗 M2e 单克隆抗体或 NA 多克隆抗血清孵育，再与荧光标记的二抗孵育，在荧光显微镜下观察拍照。对于细胞 ELISA，孵育 HRP 标记的抗小鼠 IgG 抗体，用 TMB 显色，通过 ELISA 读数仪测定吸光度。
- 小鼠和免疫：选用 BALB/c 小鼠，进行肌肉注射免疫。实验分为不同组，分别接种 NA mRNA - LNP、灭活裂解疫苗，或两者联合接种。免疫后用致死剂量的病毒攻击小鼠，监测体重变化，对体重损失超过 20% 的小鼠进行安乐死。
- ELISA 抗体和细胞因子产生：收集免疫血清，通过 ELISA 测定抗原特异性 IgG 抗体水平。使用相应试剂盒，测定免疫小鼠感染后肺提取物中细胞因子和趋化因子的水平。
- 神经氨酸酶抑制测定：用胎球蛋白包被 96 孔板，与病毒和免疫血清孵育，再加入 HRP - 结合的花生凝集素，用 TMB 显色，测定吸光度，评估 NAI 活性。
- 血凝抑制测定：对免疫小鼠血清进行处理后，与病毒孵育，加入鸡红细胞，测定 HAI 滴度。
- 肺病毒滴定：收获感染小鼠的肺组织，制备肺提取物，接种到鸡胚中，通过 HA 测定评估病毒滴度，以 50% 鸡胚感染剂量（EID50）/mL 表示。
- 流式细胞术：收集肺组织和脾脏样本，用特定抗体染色，分析炎症细胞浸润、记忆表型 T 细胞、生发中心 B 细胞、记忆 B 细胞和 Tfh 细胞等。通过刺激后对细胞内细胞因子染色，评估抗原特异性 T 细胞反应。
- 统计分析：实验结果以平均值 ± 标准误差（SEM）表示，使用单因素方差分析（one - way ANOVA）、Tukey 多重比较检验和双因素方差分析（two - way ANOVA）进行统计分析，P < 0.05 表示差异有统计学意义，使用 GraphPad Prism 9 软件进行数据分析，实验设置足够样本量（n = 3 - 10 只小鼠 / 组）以确保能检测到组间差异。
