揭秘牛溶血曼海姆菌毒力 “密码”：荚膜与 LPS 唾液酸化基因缺失突变体的关键作用

本文聚焦牛呼吸道疾病复合体（BRDC）的主要致病菌牛溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）。通过构建荚膜缺陷（Δcap）和脂多糖（LPS）唾液酸化缺陷（ΔneuA）突变体，在犊牛肺攻毒模型中研究其毒力变化，为防控 BRDC 提供新思路。

　　

引言

牛呼吸道疾病复合体（BRDC）是一种多因素综合征，给养牛业带来巨大经济损失。牛溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）是 BRDC 的主要致病菌，其血清型 1 和 6 常引发急性纤维蛋白性肺炎。该菌含有多种毒力因子，包括白细胞毒素、荚膜、脂多糖（LPS）等。虽然此前对荚膜和 LPS 唾液酸化在体外的作用有所研究，但在宿主体内的作用尚不明确。本研究旨在构建并验证牛溶血曼海姆菌血清型 1 的荚膜（Δcap）和 LPS 唾液酸化缺陷（ΔneuA）突变体，评估其在体内外的特性，探究这些毒力因子在免疫逃避、细菌定植和肺部病变发展中的作用。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：选用牛溶血曼海姆菌 D153 野生型（WT）菌株，它是从牛肺中分离得到的血清型 1 菌株，以此为基础构建 D153 Δcap（荚膜缺陷突变体）和 D153 ΔneuA（LPS 唾液酸化缺陷突变体）菌株。将这些菌株在添加 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA II）平板上，于 37°C、7.5% CO₂环境中培养过夜。
2. 细菌生长曲线分析：使用 Bioscreen C° Pro 自动化微生物生长曲线分析系统，通过测量 600nm 处的光密度（OD_600nm）评估菌株生长模式。将培养过夜的 WT、Δcap和 ΔneuA突变体菌株调整 OD_600nm至 0.6（约含 5×10⁸CFU/mL），在脑心浸液（BHI）肉汤中进行 1:10 系列稀释，取 200μL 稀释液加入 96 孔板，在 37°C 下连续振荡培养，每小时记录一次 OD_600nm，持续 24h，以 BHI 培养基作为阴性对照，并用 MS Excel 分析数据绘制生长曲线。
3. 构建基因缺失突变体：利用温度敏感性质粒 pCT109GA189-Kan，对牛溶血曼海姆菌 D153 菌株的荚膜（糖基转移酶 ABCD）和 LPS 唾液酸化（neuA，胞苷单磷酸 - N - 乙酰神经氨酸合成酶）基因进行框内缺失突变。针对荚膜突变体，通过 PCR 检测验证染色体上荚膜基因座的缺失，使用的引物对为 Mh cap F（5′-TGA TGA AGC TCT GGA AGT AGC TGA T-3′）和 Mh cap R（5′-GGT AGG CTA GAG CAG GCT GAA-3′）。此前已构建并验证了 D153 ΔneuA突变体。
4. 全基因组测序：采用 Promega 全血 DNA 提取试剂盒从荚膜突变体中提取基因组 DNA，用 Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（Illumina）进行文库制备，在 MiSeq 平台上进行 250bp 双端测序（2×250）。使用 FASTQC（0.12.1 版本）评估原始序列质量，用 Trimmomatic（0.39 版本）去除接头和过滤低质量序列，参数调整为 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:36。将质量过滤后的 Illumina 读数，使用 Hisat2（2.2.1 版本）标准参数比对到 D153 牛溶血曼海姆菌参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP005972.1/ ），不进行剪接比对。利用 Samtools（1.17 版本）的排序和索引功能对结果比对文件进行处理，最后使用 Integrative Genomics Viewer 可视化比对文件与 D153 基因组的比对情况。
5. 血液相关检测和细菌杀伤试验：按照之前的方法进行采血、全血细胞计数（CBC）分析和细菌杀伤试验。在全血细菌杀伤试验中，将 100μL 新鲜采集的肝素抗凝血液（约含 5×10⁵个中性粒细胞和单核细胞）与 5μL WT、Δcap或 ΔneuA突变体（约 5×10⁶CFU）在磷酸盐缓冲液（PBS）中混合，在 37°C、CO₂培养箱中孵育 1h，之后通过在 PBS 中进行 10 倍系列稀释，将稀释液接种在 TSA II 血琼脂平板上，在 37°C、CO₂培养箱中过夜培养，计算接种物和孵育后血液样本中的细菌 CFU。血清（或补体）细菌杀伤试验方法类似，将 95μL 正常或热灭活血清与 5μL 细菌（约 5×10⁶CFU）在 37°C 孵育 1h。
6. 犊牛肺攻毒实验模型：选取 12 头 7 - 8 周龄初乳剥夺的荷斯坦和荷斯坦 - 安格斯杂交犊牛，分为三组，每组 4 头。分别为 WT 组、荚膜突变体（Δcap）组和 LPS 唾液酸化突变体（ΔneuA）组。犊牛饲养在室内隔离室，每天喂食两次犊牛起始料（Calf Startena；Purina Mills）和干草块，自由饮水。通过气管内接种相应的牛溶血曼海姆菌接种物（WT、Δcap或 ΔneuA，约 5×10⁸CFU 溶于 50mL Earle 平衡盐溶液 [EBSS]），随后再注入 50mL EBSS。
7. 观察、尸检和组织病理学检查：饲养员和科研人员每天观察犊牛三次，记录肺炎症状，如厌食、咳嗽、呼吸频率增加、流鼻涕和发烧等。在细菌攻毒后 2 - 3 天，对犊牛实施安乐死（静脉注射戊巴比妥钠）。尸检时，采集有病变和无病变的肺组织样本进行组织病理学分析。将肺部分为八个单独的肺叶，通过目视观察和触诊估计每个肺叶中受影响肺组织的百分比，包括实变和肺不张区域。总肺病变评分是八个肺叶评分之和，计算方法是每个肺叶的肺病变体积估计百分比乘以其对气体交换的近似贡献。每个肺叶样本在 10% 中性缓冲福尔马林固定至少 24h，然后转移到 70% 乙醇中，采用标准石蜡包埋技术处理。将含有肺组织的显微镜载玻片用苏木精和伊红染色。同时，从八个肺叶中各取 1 - 3g 肺标本进行细菌培养。
8. 肺标本中细菌载量的定量：向肺组织中加入 EBSS，使肺组织加液体体积达到组织重量的 10 倍。使用组织匀浆器在 50mL 锥形聚丙烯管中匀浆肺标本，得到 10:1（体积：重量）的初始稀释液。在常规细菌培养中，用 EBSS 进行 10 倍系列稀释，取 100μL 稀释液重复涂布在含有 5% 脱纤维牛血的血琼脂平板上，在 37°C 孵育过夜，计数菌落以确定每克肺组织中的 CFU。
9. 统计分析：使用 GraphPad Prism（9.5.1 版本）进行重复测量方差分析（ANOVA）、单因素方差分析和 Fisher 精确检验，P值小于 0.05 表示差异显著。

结果

1. 突变体的构建和确认：牛溶血曼海姆菌 D153 血清型 1 菌株的荚膜生物合成基因簇包含四个基因座，本研究针对糖基转移酶基因组位点（locus ID: F382_08110、locus ID: F382_08105、locus ID: F382_08100 和 locus ID: F382_08095），利用含有wecC（也称为nmaB）和cpxD（也称为wza）替换序列的温度敏感性质粒 pCT109GA189-Kan，删除糖基转移酶 A、B、C 和 D 基因，成功构建了荚膜缺失突变体。通过血清凝集试验和 PCR 分析确认了荚膜基因的成功缺失，全基因组测序表明突变体仅在荚膜糖基转移酶 A、B、C 和 D 基因簇发生约 5,000bp 的缺失，位于wecC和cpxD之间。此前已构建并确认了 D153 菌株neuA基因的缺失。
2. 菌株生长动力学相似：在 37°C 的 BHI 肉汤中培养 24h，结果显示 WT、Δcap和 ΔneuA突变体菌株的生长动力学相似，表明cap和neuA基因的缺失对细菌生长速率没有显著影响。
3. 突变体对杀伤更敏感：用牛的肝素化全血进行细菌杀伤试验，全血细胞计数显示每 100μL 血液样本约含 3.7×10⁵个中性粒细胞和 1.5×10⁵个单核细胞。将血液样本与细菌按 1:10 的感染复数（细胞：细菌）孵育 1h 后，统计分析发现 ΔneuA突变体的菌落数显著低于 WT 菌株（P<0.0001），Δcap突变体的菌落数也显著低于 WT 菌株（P = 0.0032），且 ΔneuA突变体比 Δcap突变体对吞噬杀伤更敏感（P = 0.0002）。在补体介导的血清杀伤试验中，当菌株与正常血清孵育时，ΔneuA突变体的数量显著低于 WT 和 Δcap突变体（P<0.0001）。这些结果表明，具有唾液酸化 LPS 的牛溶血曼海姆菌对吞噬和补体介导的杀伤机制具有抗性，而荚膜突变体虽对吞噬介导的杀伤敏感，但由于其唾液酸化 LPS，对正常牛血清补体介导的杀伤具有抗性。
4. 突变体毒力降低：接种 WT 牛溶血曼海姆菌的犊牛表现出中度肺炎临床症状，肺部出现广泛实变和出血，平均约 20% 的肺组织受影响，病变主要集中在右前叶和右中叶（后半部分），肺实变率约为 29.5% - 50%。相比之下，接种 Δcap突变体的犊牛临床症状轻微，肺部病变约影响 5% 的肺组织；接种 ΔneuA突变体的犊牛临床症状和肺实变模式（约 4%）与接种 Δcap突变体的犊牛相似。
5. 突变体肺病变较轻：肺组织的组织病理学分析显示，接种 WT 菌株的犊牛肺部病变最严重，表现为广泛的化脓性肺炎，支气管和细支气管内有密集的中性粒细胞浸润，并延伸到周围实质，肺泡间隔因巨噬细胞和充血而弥漫性扩张，肺泡结构常被破坏，还有坏死和化脓性渗出物、血管损伤、出血和纤维蛋白细胞血栓。接种 Δcap突变体的犊牛肺部病变较轻，肺泡间隔有炎症浸润，偶见小的纤维蛋白细胞血栓，中性粒细胞仍可见，但病变程度较轻，充血减少，肺泡结构保存较好。接种 ΔneuA突变体的犊牛肺部病变最轻，肺泡间隔主要是巨噬细胞浸润，中性粒细胞比 WT 和 Δcap组少，纤维蛋白沉积和组织破坏最小，肺泡结构基本完整。这表明 Δcap突变体仍保留一些诱导肺损伤的毒力因子，但作用明显弱于 WT 菌株；而 ΔneuA突变体基因的破坏显著降低了其引起严重肺部病变的能力。
6. 突变体感染肺组织细菌载量降低：通过培养法对牛肺中的细菌载量进行计数，结果显示所有研究组的肺组织中均检测到牛溶血曼海姆菌。接种 WT 菌株的犊牛肺样本平均细菌计数显著高于 Δcap和 ΔneuA突变体（5.4×10⁴CFU/g，P<0.05），右中叶后半部分细菌载量最高（3.9×10⁵CFU/g）。Δcap突变体的细菌回收率显著降低，平均为 1.7×10³CFU/g，部分肺叶（如左前叶、左中叶和右中叶前半部分）细菌完全清除。ΔneuA突变体的平均细菌回收率最低，为 4.1×10²CFU/g。这些结果表明，荚膜和 LPS 唾液酸化均有助于牛溶血曼海姆菌的毒力。

讨论

本研究首次在犊牛肺攻毒模型中研究牛溶血曼海姆菌荚膜或唾液酸缺陷突变体的毒力。此前的研究仅表明白细胞毒素是牛溶血曼海姆菌在犊牛攻毒研究中的重要毒力决定因素，而本研究中构建的荚膜缺陷（Δcap）突变体和之前构建的 LPS 唾液酸化缺陷（ΔneuA）突变体，在体外生长曲线分析中显示与 WT 菌株生长模式无显著差异。体外细菌杀伤试验（全血和血清杀伤）表明，ΔneuA突变体比 WT 和 Δcap突变体对吞噬和补体介导的杀伤更敏感，说明唾液酸化在牛溶血曼海姆菌的免疫逃避中起关键作用。

接种 WT 牛溶血曼海姆菌的犊牛表现出典型的肺炎症状和病变，而接种 Δcap或 ΔneuA突变体的犊牛临床症状和肺部病变明显减轻。ΔneuA突变体在肺组织中的细菌载量比 Δcap突变体更低，且在体外对吞噬和补体介导的杀伤均敏感，推测其肺部病变减轻的原因可能在于此。虽然两个突变体都含有功能性白细胞毒素，但毒力仍显著低于野生型菌株，可能是因为在白细胞毒素发挥细胞溶解作用之前，犊牛的先天免疫细胞和补体有效地降低了细菌载量，减轻了疾病严重程度。

本研究中两个突变体毒力减弱的结果与其他病原体的研究相似，如相关病原体多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）的荚膜突变体因对吞噬杀伤更敏感而毒力显著降低，这进一步支持了牛溶血曼海姆菌荚膜在免疫逃避中的重要性。此外，与野生型牛溶血曼海姆菌类似，具有唾液酸化脂寡糖（LOS）的睡眠嗜组织菌（Histophilus somni）在体外对吞噬和血清杀伤具有抗性。

综上所述，本研究中两个突变体在犊牛体内毒力降低和肺部病变减轻的结果表明，针对荚膜或 LPS 唾液酸化生物合成途径可能是开发抗牛溶血曼海姆菌感染新疫苗的有前景的方法。