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本文聚焦弓形虫（Toxoplasma gondii）穿越生物屏障机制。研究发现，弓形虫效应蛋白 GRA24 经 p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路诱导组织金属蛋白酶抑制剂 1（TIMP1）分泌，促进其跨细胞单层迁移，且不破坏屏障完整性，为深入理解弓形虫感染机制提供关键线索。
引言
在脊椎动物体内，肠道屏障和血脑屏障（BBB）对维持器官稳态至关重要，它们通过紧密连接（TJs）限制和调节物质通过。弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛存在于温血脊椎动物（包括人类）体内的寄生虫，主要有 I、II、III 三种克隆谱系。
感染后，弓形虫速殖子先在肠道壁内复制，随后经循环系统扩散，最终到达中枢神经系统（CNS）形成潜伏包囊。虽然慢性感染通常无症状，但急性原发性感染或再激活会对胎儿和免疫功能低下者造成严重疾病。
弓形虫速殖子能利用滑行运动侵入几乎任何有核细胞，并在组织微环境中迁移，可在体外穿过极化的上皮和内皮细胞单层。在感染过程中，炎症可能破坏肠道和血脑屏障的功能，而组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）在调节炎症和维持屏障功能方面发挥着重要作用，其中 TIMP1 除了调节基质金属蛋白酶（MMPs）活性外，还有多种非 MMP 依赖的功能。已有研究发现，弓形虫感染小鼠的血清和脑组织中 TIMP1 水平升高，且 TIMP1 缺陷小鼠的脑内寄生虫负荷降低，因此，探究 TIMP1 在弓形虫穿越细胞屏障过程中的作用具有重要意义。
结果
- TIMP1 在细胞中的表达和分泌：用新鲜逸出的弓形虫 I 型（RH）速殖子分别刺激小鼠脑内皮细胞（bEnd.3）和人肠上皮细胞（Caco - 2）的融合单层，发现感染导致 bEnd.3 细胞中Timp1 mRNA 表达持续升高，TIMP1 蛋白分泌也相应增加，而Timp2 mRNA 表达无明显变化。同样，Caco - 2 细胞在感染弓形虫速殖子后，TIMP1 mRNA 表达和 TIMP1 蛋白分泌增加，而脂多糖（LPS）或速殖子裂解物刺激则无明显影响。这表明弓形虫感染能特异性地促进小鼠脑内皮细胞和人肠上皮细胞中 TIMP1 的 mRNA 表达和蛋白分泌。
- 重组 TIMP1 对寄生虫迁移的影响：在 Transwell 实验中，添加重组 TIMP1（rTIMP1）显著增加了弓形虫速殖子跨极化 Caco - 2 和 bEnd.3 单层的迁移频率，同时细胞单层的跨上皮电阻（TCER）和对荧光素异硫氰酸酯 - 葡聚糖（FITC - dextran）的通透性未发生明显变化，说明 rTIMP1 促进迁移的作用并非通过破坏屏障完整性实现。此外，抑制 MMPs 对速殖子迁移频率影响不显著，而在 MMP 抑制剂存在的情况下添加 rTIMP1 仍能提高迁移频率，表明 TIMP1 对迁移的促进作用不依赖于 MMPs。通过 shRNA 介导的基因沉默降低 bEnd.3 细胞中Timp1表达后，弓形虫速殖子的迁移频率升高，且不影响细胞单层的 TCER 和通透性，进一步证明 TIMP1 与弓形虫迁移之间存在密切联系。
- 影响 Timp1 表达的信号通路和寄生虫分泌途径：使用针对不同信号通路的抑制剂处理细胞，发现抑制 NF - κB 和 STAT 信号通路对弓形虫感染诱导的Timp1表达无显著影响，而抑制 p38 和 JNK 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路可降低或消除Timp1的上调，抑制 MEK（ERK1/2）信号通路对Timp1表达影响不明显。研究还发现，敲除 MYR1 或 GRA24（通过 MYR 转运的效应蛋白，可作用于 p38 MAPK）可消除Timp1的诱导表达，重新构建 GRA24 则能恢复Timp1表达，而其他一些与 MYR 相关或无关的效应蛋白突变体对Timp1表达无明显影响，这表明 MYR1 依赖的 GRA24 效应蛋白在弓形虫诱导的Timp1表达中起关键作用。
- p38 MAPK 信号通路和 GRA24 在 Timp1 表达及速殖子迁移中的作用：用弓形虫 GRA24 突变体或 p38 抑制剂处理 bEnd.3 单层细胞，通过蛋白质免疫印迹分析发现，GRA24 可导致 bEnd.3 细胞中 p38 磷酸化，p38 抑制可降低速殖子迁移频率，添加 rTIMP1 则能在 p38 抑制剂存在的情况下重新提高迁移频率，证实了 TIMP1 对速殖子迁移的促进作用。此外，rTIMP1 能使 p38 磷酸化水平升高，与弓形虫感染时的反应相似，表明感染细胞分泌的 TIMP1 可能激活未感染的旁观者细胞中的 p38 信号通路，进一步说明寄生虫效应蛋白 GRA24 和宿主 p38 MAPK 信号通路在Timp1表达及弓形虫速殖子跨极化单层迁移中发挥重要作用。
讨论
本研究揭示了 TIMP1 在弓形虫跨极化内皮和上皮细胞单层迁移中的促进作用。弓形虫速殖子感染能特异性诱导 TIMP1 表达和分泌增加，rTIMP1 可增强弓形虫速殖子的迁移，且不破坏屏障完整性，这表明 TIMP1 在增加细胞单层对弓形虫的通透性时，能维持整体屏障功能。
研究还确定了寄生虫效应蛋白 GRA24 通过 p38 MAPK 信号通路诱导Timp1表达的机制，与其他可能参与 TIMP1 表达调控的信号通路（如 GRA15/NF - κB、ROP16/STAT）相比，GRA24/p38 MAPK 信号通路是驱动弓形虫诱导细胞单层中Timp1表达的主要途径。
此外，rTIMP1 增加弓形虫速殖子迁移频率的作用不依赖于 MMP 抑制，且在不同基因型的弓形虫菌株和不同类型的细胞单层中均有体现。TIMP1 在肿瘤和维持屏障功能方面具有双重作用，在弓形虫感染中，其作用机制可能与影响黏着斑激酶（FAK）和紧密连接稳定性有关，这需要进一步研究。
在弓形虫感染过程中，TIMP1 可能通过促进细胞外速殖子和感染白细胞的迁移，同时减少 MMP 介导的炎症，在组织微环境中发挥促进寄生虫传播的作用。这一推测与弓形虫感染的肠道阶段和中枢神经系统定植通常无症状或症状轻微的现象相符。
细菌和病毒感染会破坏 MMP/TIMP 的调节平衡，弓形虫感染虽在体外能升高 TIMP1 表达，但对 MMP 表达影响较小，其抗炎作用是否在体内也成立尚待研究。TIMP1 在其他感染性疾病（如严重疟疾、病毒性或细菌性脑膜炎）中也有报道，但在不同疾病中的变化并不一致，如结核分枝杆菌感染时升高的是 TIMP2 而非 TIMP1。
总之，本研究揭示了 TIMP1 在弓形虫穿越细胞屏障过程中的重要作用，基于体外研究结果推测其可能通过多种方式促进弓形虫传播，但这些作用还需在体内进一步深入研究。
材料和方法
- 细胞系、寄生虫培养和感染实验：使用人包皮成纤维细胞（HFF - 1）、Caco - 2 细胞和 bEnd.3 细胞，在含有特定成分的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，定期检测支原体确保细胞无污染。弓形虫速殖子在 HFF - 1 单层细胞中连续传代培养，实验时用新鲜逸出的速殖子感染 Caco - 2 和 bEnd.3 细胞，感染频率控制在 50 - 80%，部分实验在感染前 2 小时用抑制剂、LPS 或弓形虫裂解物处理细胞。
- 细胞极化和迁移实验：将 Caco - 2 或 bEnd.3 细胞培养至 80% 汇合后，接种到培养小室中，培养 5 天直至细胞极化，通过测量 TCER 确定极化状态。迁移实验时，将新鲜逸出的速殖子加入到极化的细胞单层上，允许其迁移 18 小时，部分实验同时添加 rTIMP1。迁移结束后，通过斑块试验定量迁移的速殖子数量，并测量细胞单层的 TCER 和对 FITC - dextran 的通透性。
- 免疫荧光显微镜观察：将 Caco - 2 和 bEnd.3 细胞接种在明胶包被的盖玻片上，用弓形虫速殖子感染或不感染，固定后进行透化处理，用抗 ZO1 抗体、二抗和 DAPI 染色，在显微镜下观察。
- 慢病毒载体生产和体外转导：使用慢病毒载体 pLL3.7 表达靶向小鼠Timp - 1 mRNA 的 shRNA（shTIMP1）和非相关序列（shLuc），将相关质粒共转染到 Lenti - X 293T 细胞中生产慢病毒颗粒，收集上清并过滤。用慢病毒颗粒转导 bEnd.3 细胞，经过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出稳定表达的细胞系。
- 定量聚合酶链反应（qPCR）：收集细胞，提取总 RNA 并逆转录为 cDNA，使用特定引物和 SYBR green PCR master mix 进行 qPCR，以 importin - 8 和 TATA 结合蛋白为内参基因，用 ΔCt 方法分析结果，以未感染细胞为对照计算相对表达倍数。
- 蛋白质免疫印迹（Western blot）：培养 bEnd.3 细胞单层，处理或感染后用 RIPA 缓冲液裂解细胞，进行 SDS - PAGE 凝胶电泳，将蛋白质转移到 PVDF 膜上，用特定抗体进行免疫印迹，通过增强化学发光法检测蛋白质，并用 ImageLab 软件进行密度分析。
- TIMP1 酶联免疫吸附试验（ELISA）：收集 Caco - 2 和 bEnd.3 细胞感染弓形虫速殖子后的上清液，使用 ELISA 试剂盒检测 TIMP1 含量。
- 统计分析：使用 Prism 软件或 R 语言进行统计分析，根据实验设计、假设、数据分布等选择合适的假设检验方法，计算曲线下面积，以 P < 0.05 为具有统计学意义。
