探秘白色念珠菌 Rap1：解锁铁稳态、唑类耐药及致病力新奥秘

白色念珠菌（Candida albicans）是重要致病真菌。本文研究发现，Rap1 影响其铁稳态，参与铁摄取和相关基因调控，与低铁条件下唑类耐药有关，敲除RAP1会降低其在小鼠感染模型中的毒力，为深入了解真菌致病机制提供新视角。

　　

研究背景

白色念珠菌是一种常见的共生真菌，通常存在于人体皮肤和黏膜表面，但它也是机会致病菌，能引发从浅表到危及生命的侵袭性感染，尤其是在免疫功能低下的患者中。而且，白色念珠菌的抗真菌耐药性对公共卫生构成了新的威胁，已被列入世界卫生组织的真菌优先病原体名单。

铁是白色念珠菌及其宿主必需的微量营养素，在宿主 - 病原体相互作用中起着关键作用。人体会采用多种策略限制白色念珠菌获取铁，即营养免疫，如转铁蛋白和铁蛋白等宿主蛋白会螯合铁。为适应铁限制的宿主环境，白色念珠菌进化出了三种获取铁的机制：一是利用还原铁摄取系统获取游离铁并从宿主铁结合蛋白中螯合铁，三价铁（Fe³⁺）先被铁还原酶还原为二价铁（Fe²⁺），再经多铜铁氧化酶氧化，由高亲和力铁转运蛋白 Ftr1 转运进入细胞；二是通过特定的血红蛋白结合蛋白系统，借助 Csa2、Rbt5 和 Pga7 等 hemophore 蛋白从宿主血红蛋白和血清白蛋白中获取铁，血红素被内吞进入细胞后由液泡血红素加氧酶 Hmx1 降解释放铁；三是通过铁载体转运蛋白 Sit1 摄取异源铁载体。

铁的获取与白色念珠菌的致病性和毒力密切相关，例如，铁还原酶CFL1缺失突变体在小鼠全身感染模型中毒力减弱，缺乏FTR1的突变体无法在小鼠中建立全身感染。此外，铁与抗真菌药敏性也有关联，铁耗竭会使白色念珠菌对抗真菌药物更敏感。

Rap1 是一种在哺乳动物、原生动物和酵母中保守的 DNA 结合蛋白。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，ScRap1 调节端粒稳态和长度，还具有非端粒功能，包括基因转录、调节铁还原酶FRE1、DNA 修复和核糖体蛋白基因等。在白色念珠菌中，Rap1 对控制端粒长度和结构至关重要，且参与细胞壁完整性、生物膜形成和毒力，但人们对其其他功能的了解仍有限。本研究旨在揭示白色念珠菌中 Rap1 此前未知的功能，基于 ScRap1 参与调节FRE1基因表达的发现，推测 Rap1 可能与铁利用相关。

实验方法

1. 菌株和生长条件：实验所用白色念珠菌菌株保存在 - 80°C，培养在 YPD 平板上，实验时将单菌落接种到相应培养基中，30°C 振荡培养。
2. RNA 测序分析（RNA-seq）：具体方法在补充材料中。
3. 铁依赖性生长分析：先将单菌落接种到 YPD 中过夜培养，再在含 400 μM BPS 的 YPD 中培养 24 h 耗尽细胞内铁，然后接种到高铁和低铁培养基中，在 96 孔板中培养 5 天，用酶标仪测量细胞生长情况。
4. RNA 提取和逆转录实时定量 PCR（qPCR）：铁饥饿处理的细胞在高铁和低铁培养基中培养 5 h 后，进行总 RNA 提取、cDNA 合成和 qPCR，用 2^?ΔΔCT 方法计算基因表达的相对倍数变化。
5. 细胞内铁水平测量：铁饥饿处理的细胞在高铁和低铁培养基中培养 5 h 后，用硝酸处理细胞，再用 ICP-MS 分析，铁含量根据细胞数量进行归一化。
6. 黄素产生测量：用不含铁的 YNB 培养基（NIM）培养细胞，铁饥饿处理 2 天后，测量上清液荧光并拍照。
7. 溶血活性测量：通过血琼脂平板和液体溶血试验测定溶血活性，血琼脂平板上计算溶血指数，液体溶血试验中测量 414 nm 处吸光度计算相对溶血率。
8. 血红素加氧酶活性测量：铁饥饿处理的细胞在含血红蛋白和 BPS 的 YPD 中培养 12 h 后，收集细胞用甲醇处理，测量 666 nm 处吸光度计算胆绿素浓度，从而确定血红素加氧酶活性。
9. 毒力测定：具体方法在补充材料中。
10. 氟康唑药敏试验：通过琼脂和肉汤微量稀释法测定氟康唑药敏性，琼脂法是将铁饥饿处理的细胞点在含或不含 BPS 和氟康唑的 YPD 平板上培养；肉汤法是根据 CLSI 的 M27 - A3 指南进行，确定 MIC50。
11. 尼罗红积累测量：铁饥饿处理的细胞在高铁和低铁培养基中培养 5 h 后，用尼罗红染色，在 96 孔板中用酶标仪检测荧光强度。
12. 统计分析：采用两尾 Student's t 检验确定样本间的显著差异，P < 0.05 表示有统计学意义。

实验结果

1. 铁响应转录组分析：对RAP1缺失（rap1Δ/Δ）和野生型菌株进行 RNA - seq 分析。在低铁条件（含 200 μM BPS 的 YPD 培养基）下，rap1Δ/Δ 突变体中有 118 个基因显著上调，94 个基因下调，下调基因与 “铁离子运输”“过渡金属离子运输”“铁螯合物还原酶活性” 等 GO 类别相关，部分铁还原酶和铁氧化酶基因表达降低。在高铁条件下，rap1Δ/Δ 突变体中有 552 个基因显著上调，474 个基因下调，这些差异表达基因（DEGs）被分类到多个类别，包括 “麦角甾醇生物合成过程”。RNA - seq 分析表明白色念珠菌 Rap1 在细胞稳态中发挥多种作用，包括对铁的响应。
2. Rap1 在低铁条件下的功能：通过 qPCR 检测发现，低铁条件下RAP1表达增加。ICP - MS 测量结果显示，细胞在高铁 YPD 培养基中生长时细胞内铁含量高于低铁 YPD 加 BPS 培养基，且rap1Δ/Δ 突变体在低铁或高铁条件下细胞内铁水平均高于野生型和RAP1重新整合的对照菌株。此外，低铁条件下，所有测试菌株分泌的黄素水平均升高，但rap1Δ/Δ 突变体的黄素产生比对照菌株减少约 50%。这些结果表明，RAP1缺失影响铁相关性状，Rap1 可能在铁限制条件下发挥作用。
3. Rap1 参与铁利用和铁摄取相关基因表达：在研究铁利用时，发现所有测试菌株在铁限制条件下生长均受抑制，且rap1Δ/Δ 突变体对铁限制更敏感，尤其在 BPS 浓度为 400 和 600 μM 时。在低铁条件下，还原铁摄取系统中CFL2和FET31基因在rap1Δ/Δ 突变体中下调，而FTR1表达增强。这表明rap1Δ/Δ 突变体在游离铁获取方面存在缺陷，影响了铁摄取相关基因的表达。
4. Rap1 与血红素和血红蛋白的获取及利用相关：在研究白色念珠菌对血红蛋白和血红素的利用时，发现所有测试菌株在含 1 mM BPS 的 YPD 肉汤中生长均有严重缺陷，添加血红蛋白和血红素可恢复野生型和RAP1重新整合对照菌株的生长，但rap1Δ/Δ 突变体在添加这些铁源时生长仍延迟。血琼脂和液体溶血试验表明，rap1Δ/Δ 突变体的溶血活性低于对照菌株。此外，低铁条件下，rap1Δ/Δ 突变体中血红素转运蛋白基因RBT5下调，而血红素加氧酶HMX1基因表达和活性均升高。这说明RAP1缺失导致铁利用和铁摄取基因表达改变，Rap1 在血红素摄取和利用中发挥作用。
5. RAP1 缺失影响氟康唑药敏性：通过琼脂和肉汤微量稀释法测定氟康唑药敏性，发现rap1Δ/Δ 突变体在低铁条件下对氟康唑更耐药，其 MIC50 高于对照菌株。进一步研究发现，低铁条件下，rap1Δ/Δ 突变体中麦角甾醇生物合成基因ERG11和ERG3表达降低，而外排泵基因CDR1和MDR1表达升高，且该突变体在低铁条件下外排泵活性更强。这表明RAP1缺失导致低铁条件下氟康唑耐药，与麦角甾醇生物合成和药物外排泵的改变有关。
6. RAP1 缺失降低白色念珠菌毒力：在小鼠全身感染模型中，野生型和RAP1重新整合菌株毒力高，感染小鼠在感染后第二天开始快速死亡，而注射rap1Δ/Δ 突变体的小鼠在 14 天内存活率超 90%。感染rap1Δ/Δ 突变体的小鼠肾脏真菌负荷显著低于感染对照菌株的小鼠，组织学检查显示，感染对照菌株的小鼠肾脏有炎症和白细胞浸润，而感染rap1Δ/Δ 突变体的小鼠则无明显细胞浸润。这表明 Rap1 参与了白色念珠菌的毒力和致病性。

研究讨论

铁对生物至关重要，但过量的铁可能产生氧化应激。宿主通过营养免疫限制病原体获取铁，因此维持铁平衡对宿主和病原体都很关键。

Rap1 参与端粒维持，但白色念珠菌 Rap1 与酿酒酵母 ScRap1 存在差异，如白色念珠菌 Rap1 缺乏 ScRap1 中与端粒调节相关的 C 末端结构域，且ScRAP1是必需基因，而RAP1对白色念珠菌的细胞活力并非必需。此前研究还发现白色念珠菌 Rap1 调节细胞壁完整性、生物膜形成和氧化应激反应，本研究则揭示了其与细胞对铁的反应之间的联系。

研究发现多个铁相关性状与 Rap1 的功能相关。虽然不能排除 Rap1 在高铁条件下的作用，但RAP1缺失在低铁条件下对这些性状的影响更明显，如对低铁诱导的黄素生成影响显著。黄素参与电子转移和氧化还原过程，与铁摄取有关，白色念珠菌的黄素生成受不同转录因子调控，未来研究 Rap1 与其他调节因子在铁响应黄素生成中的关系将很有意义。

本研究还将 Rap1 与游离铁的利用及还原铁摄取基因表达联系起来。白色念珠菌中存在由 Sef1、Hap43 和 Sfu1 组成的调节铁稳态的回路，探究 Rap1 与这些转录因子在铁调节中的相互作用很有必要。此外，Rap1 似乎参与血红素和血红蛋白的利用，rap1Δ/Δ 突变体对血红素和血红蛋白的利用及溶血能力均降低，且 RNA - seq 数据显示rap1Δ/Δ 突变体中ECE1表达上调，未来可研究 Rap1 对 candidalysin 产生的影响。

氟康唑是治疗念珠菌感染的一线药物，铁与唑类药敏性之间存在复杂联系。本研究中，rap1Δ/Δ 突变体在低铁条件下对氟康唑更耐药，可能是由于膜脂质相和不对称性改变影响了膜流动性和被动扩散，同时该突变体中药物外排泵基因表达和活性升高。这表明 Rap1、铁和氟康唑之间存在复杂的关联。

虽然本研究表明 Rap1 影响铁稳态和毒力，但它在白色念珠菌中还有其他功能。在人类中，铁稳态、端粒维持和疾病之间存在关联，而 Rap1 在白色念珠菌中具有多种功能且参与端粒维持，其对铁稳态和毒力的影响可能是间接的，涉及端粒相关因素，这需要进一步研究来阐明。