创新混合模式 LC-MS 法：全面剖析 NAD 代谢组，解锁健康密码

为解决 NAD+及其代谢物分析难题，研究人员开展混合模式（反相 / 阴离子交换）色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）法研究。结果显示该方法与 NAD-Glo 检测法高度相关，能评估 NAD+代谢组变化。这为研究 NAD+代谢提供新平台，助力相关疾病研究。

　　在生命的微观世界里，细胞如同一个个精密运转的小工厂，而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺）则是维持这些工厂正常运作的关键 “燃料” 之一。NAD⁺不仅参与细胞的能量代谢，还在 DNA 损伤修复、基因表达调控等诸多重要生理过程中扮演着不可或缺的角色。随着年龄的增长，NAD⁺在体内的水平逐渐下降，这一变化与多种衰老相关的疾病，如代谢紊乱、神经退行性疾病等紧密相连。

目前，对于 NAD⁺代谢的研究虽有一定进展，但仍面临诸多挑战。一方面，NAD⁺及其代谢物具有极性强、在反相色谱柱上保留性差的特点，这使得同时分析它们变得困难重重。另一方面，现有的检测方法，如常用的 NAD-Glo 检测法，虽广泛应用，但只能检测 NAD⁺，无法全面反映 NAD⁺代谢组的变化情况，难以深入探究疾病机制以及不同疗法对 NAD⁺代谢的影响。

为了突破这些困境，来自 AbbVie（位于美国伊利诺伊州北芝加哥）的研究人员 Omprakash Nacham、Jordan W. Brown 等开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种高效的分析方法，以实现对 NAD⁺及其代谢物的全面检测，并验证 NAD-Glo 检测法的数据，从而更深入地理解 NAD⁺代谢途径生物学。

研究最终成功开发并优化了一种基于混合模式（反相 / 阴离子交换）色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）的方法。该方法可用于分析生物样品基质中的 NAD⁺前体及其代谢产物，且与 NAD-Glo 检测法具有高度的相关性（R²=0.94），能更全面地评估 NAD⁺代谢组的变化。这一成果对于深入了解 NAD⁺代谢在健康与疾病中的作用具有重要意义，为相关疾病的研究和治疗提供了新的视角与有力工具。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究中用到的主要关键技术方法包括：首先是混合模式色谱技术，通过筛选不同的色谱柱，最终选用 C18-AX 柱进行 NAD⁺代谢物的分离；其次是串联质谱技术（MS/MS），对选定的色谱柱条件和质谱参数进行优化，实现对目标代谢物的检测与定量；此外，还涉及动物实验，选用 C57Bl/6J 雌性小鼠进行烟酰胺（Nicotinamide，NAM）给药实验，并采集组织样本；细胞实验则以 L6 成肌细胞为研究对象进行相关处理 。

研究结果

1. 增强 NAD⁺途径代谢物保留的策略：研究人员发现，NAD⁺代谢物的同时色谱分离存在困难，因为其极性强、在反相柱上保留差。尝试多种色谱方法后，发现基于多孔石墨碳（PGC）柱的方法虽能实现基线分离，但存在柱压升高、保留时间漂移等问题。
2. 混合模式柱色谱法分析 NAD⁺途径代谢物：混合模式反相 / 阴离子交换色谱法对含羧酸基团的极性代谢物表现出良好的保留和选择性。研究人员评估了多种 CSH 柱，发现 C18-AX 柱对大多数 NAD⁺分析物的保留因子（k）较高，峰形改善明显，对 2-PY 和 4-PY 等位置异构体也有出色的选择性，因此选用该柱进行后续研究。
3. C18-AX 方法的优化和验证：对流动相离子强度和柱温等方法属性进行优化，确定了最佳的实验条件。该方法在多数 NAD⁺代谢物的检测中表现出良好的线性范围（10 - 0.01μM），日内精密度高（1μM 时 % RSD<10%，LLOQ 时 % RSD<15% ），准确度也较高（多数分析物回收率≥80%），检测限（LOD）与文献报道相近或更优。
4. NAD⁺的分析 ——NAD-Glo 和 LC-MS/MS 的比较：通过对 L6 细胞和小鼠肺组织样本的分析，发现 LC-MS/MS 检测法与 NAD-Glo 检测法结果具有高度相关性。在 L6 细胞实验中，用 NR 或 NMN 处理后，两种方法均检测到 NAD⁺水平显著增加；在小鼠肺组织实验中，NAM 给药后，两种方法也都观察到 NAD⁺水平呈剂量依赖性增加。
5. 体内研究中 NAM 补充后 NAD⁺代谢组调节的评估：在小鼠体内实验中，研究人员发现 NAM 补充可使肺组织和皮肤组织中的 NAD⁺、NR、NMN、NAM 和 m-NAM 水平呈剂量依赖性增加，尤其在 900mg/kg 剂量时变化显著。这表明同时测量 NAD⁺及其代谢物能更全面地评估 NAM 补充的效果。

研究结论和讨论

本研究成功开发并验证了一种基于 LC-MS/MS 的方法，用于同时检测和定量细胞和组织裂解物中 NAD⁺前体处理后的代谢物。该方法与 NAD-Glo 检测法高度相关，为交叉验证 NAD-Glo 数据和测量同一样本中的 NAD⁺代谢物提供了平台。这不仅有助于更深入地理解 NAD⁺途径生物学，还为研究与 NAD⁺代谢相关的疾病机制、评估治疗效果提供了有力的工具，在研究和药物研发领域具有重要的应用价值。