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本文聚焦基于胶原蛋白的微纳凝胶递送系统，详细阐述其制备技术、释放机制，如物理化学交联策略、多种制备方法，以及在骨修复、伤口愈合等生物医学领域的应用，探讨面临的挑战与前景，为相关研究提供全面参考。
引言
水凝胶是一类具有高含水量的亲水性聚合物三维交联网络，因其可调节的孔隙率、可控的机械特性和高渗透性，在组织工程和生物医学领域备受关注。依据凝胶支架尺寸，水凝胶可分为宏观凝胶、微凝胶和纳米凝胶。与传统的大块凝胶相比，微 / 纳米凝胶尺寸小、比表面积大，具有出色的载药效率、对周围环境的高响应性以及更强的扩散性和流动性。
胶原蛋白作为脊椎动物细胞外基质的主要天然成分，是制备微 / 纳米凝胶的重要天然生物材料。它能与多种细胞表面受体（如整合素）结合，促进细胞特定形态的形成，支持细胞黏附、增殖和分化。不过，纯胶原蛋白水凝胶网络在水化时，可控的机械强度和结构稳定性有所欠缺。明胶是最常见且应用广泛的胶原蛋白衍生物，与胶原蛋白相比，它具有更好的水溶性、更强的结构可修饰性、更低的制备成本和独特的热敏性。
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶的交联与制备技术
物理和化学交联策略
胶原蛋白衍生的微 / 纳米凝胶主要通过物理或化学交联形成三维网络。物理交联的微 / 纳米凝胶通过超分子相互作用（如氢键、疏水相互作用或静电相互作用等非共价相互作用）形成，具有可逆、自发、无需有毒交联剂的特点，生物相容性好；化学交联的凝胶则通过共价键形成，机械性能更高、更稳定，反应效率高、时间短，但化学交联过程中产生的有毒试剂或自由基可能对细胞构成潜在风险。
胶原蛋白和明胶都能形成物理交联水凝胶，不过二者凝胶化机制不同。胶原蛋白在生理 pH 值 7.4 或接近 7.4 时，从低温加热到 37°C 会自组装成凝胶状网络；明胶作为可逆的溶胶 - 凝胶材料，在熔点（27°C - 34°C）以上溶解，冷却至熔点以下时恢复螺旋结构。此外，明胶分子链中的羧基能与金属离子形成离子键，通过静电相互作用构建凝胶网络。
除物理交联外，胶原蛋白基聚合物分子结构中的胺基和羧基等活性基团，为化学交联提供了众多机会。席夫碱反应可用于化学交联胶原蛋白基材料，常见方法是在硼砂存在下氧化多糖（如藻酸盐醛和阿拉伯胶醛），使醛基或酮基与明胶中的游离氨基发生缩合反应。这种交联方法具有可逆性，亚胺键在特定条件（如低 pH 值）下可断裂和重新形成，赋予水凝胶自愈合和刺激响应特性。戊二醛是常用的交联剂，与胺化合物反应形成席夫碱，多个席夫碱键可进一步缩合，形成稳定的交联结构，导致反应不可逆。另外，甲基丙烯酸化明胶可通过光引发剂和紫外线照射进行光交联，常用的光引发剂有锂酰基膦酸盐和 2 - 羟基 - 1 - [4 - (2 - 羟基乙氧基) 苯基] - 2 - 甲基 - 1 - 丙酮（Irgacure 2959） 。
微凝胶制备
通过交联策略，可采用多种制造方法将胶原蛋白衍生的水凝胶制备成微凝胶。不同应用对微凝胶的尺寸、均匀性、稳定性和载药能力等有不同要求，因此了解当前制造工艺及其对水凝胶和所载药物最终性质的影响至关重要。
常用的制备微凝胶的方法包括传统乳液法和微流控乳液法（利用油水界面的剪切力）、喷雾干燥法和注射挤出法（利用气水界面的剪切力）。传统乳液法应用历史较长，可批量制备，典型的异相乳化包括两个连续步骤：首先将聚合物水相在含有油溶性表面活性剂的连续油相中乳化，然后用水溶性交联剂进行凝胶化。不过，该方法存在微球尺寸差异大、难以扩大规模用于工业生产等缺点。微流控乳液法在细胞可比的尺度上操作，能生产更均匀的微凝胶，同时显著减少昂贵生物试剂的消耗。微流控芯片是关键，通过改变分散相和连续相的流速，可快速生成不同尺寸和分散度的微凝胶。
喷雾干燥法是将含有药物、聚合物和颗粒的溶液或悬浮液分散到高温气流中，溶剂同时蒸发，形成直径 1 - 10μm 的干燥微球或微凝胶。该方法可一次性处理大量溶液，生产成本低，更适合工业规模的批量生产，但由于蛋白质的热敏性，更适用于胶原蛋白水解产物（如明胶）。注射挤出法利用注射针、喷射切割器和随后的凝胶浴制备胶原蛋白基微球，无需特殊有机溶剂和复杂干燥设备或芯片，常用于封装间充质干细胞 。
纳米凝胶制备
胶原蛋白衍生的纳米凝胶制备方法与微凝胶不同，通常先产生胶体纳米颗粒，再进行物理或化学交联。根据纳米颗粒的制备方式，纳米凝胶制备技术可分为两类：纳米乳化法，即制备纳米级液滴进行交联；相分离法，利用溶解度差异形成水凝胶颗粒。目前研究多采用明胶制备纳米凝胶，这得益于明胶良好的水溶性和易于分子修饰的特点。
纳米乳化法与制备微凝胶的乳液法类似，借助油溶性表面活性剂在油相中形成稳定的纳米级乳液滴，然后交联。交联后的纳米凝胶在去除有机溶剂和乳化剂后，可稳定分散在水性介质中。通过调整聚合物水相和交联剂的浓度或进料比、反应介质的 pH 值、表面活性剂的选择、交联时间和温度等，可优化纳米凝胶的尺寸和性能。相分离法通过改变温度或溶剂组成等条件使聚合物沉淀。常用的相分离方法包括去溶剂化法和纳米沉淀法。去溶剂化法是向聚合物溶液中加入反溶剂，诱导水胶体相分离和聚集；纳米沉淀法则是将明胶水溶液缓慢加入乙醇或丙酮等反溶剂中，常使用泊洛沙姆作为稳定剂，然后加入戊二醛交联纳米颗粒。
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶释放系统
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶的性质不仅取决于材料的结构和制造过程，还受周围环境的显著影响。这些水凝胶通常会与周围环境进行溶剂和溶质交换，改变其交联结构，进而影响形态、尺寸和机械性能。这意味着微 / 纳米凝胶可能对温度、pH 值和生理微环境等外部刺激敏感，由此出现了各种具有不同释放行为的环境响应性胶原蛋白微 / 纳米凝胶。
持续释放
持续释放系统旨在控制药物释放速率，维持体内有效药物浓度，减少给药频率，提高患者依从性。基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶由于其三维网络结构和合适的孔径，在生理条件下能实现药物的持续释放，适合用于靶向药物递送、伤口愈合和再生医学等领域。药物从基于胶原蛋白的水凝胶中的释放通常遵循菲克扩散（如 Higuchi 模型）或 Case II 扩散。许多释放模型中，Korsmeyer - Peppas 模型应用广泛，它能描述多种药物释放机制。一般来说，基质相对均匀或交联度较高的基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶药物递送系统，在持续释放阶段倾向于遵循 Higuchi 模型；而具有多组分基质或松散结构的系统则更倾向于遵循 Korsmeyer - Peppas 模型。
酶响应释放
酶响应性微 / 纳米凝胶能响应环境中的各种蛋白酶发生相转变，在预定时间、地点和剂量释放药物，可增强药物向疾病部位（如感染或炎症区域）的按需递送，调节药物的靶向递送。胶原蛋白及其衍生材料因自身组成易发生酶促降解，适合设计酶触发的药物释放系统。例如，胰蛋白酶可用于研究明胶基纳米凝胶的体外水解行为，该纳米凝胶在胰蛋白酶存在下可实现突发释放，有利于急性病症治疗；在无酶情况下则持续释放，能提高患者依从性并减少副作用 。
pH 响应释放
pH 响应释放机制是一种智能药物递送策略，利用材料在不同 pH 值环境中的化学或物理变化来控制药物释放。pH 值的变化会改变聚合物链的电荷，通过基质官能团、氢键和嵌入纳米颗粒之间的静电相互作用触发溶胀和药物释放。这种机制特别适用于肿瘤和抗菌治疗，因为肿瘤组织和感染细菌的组织通常比正常组织的 pH 值低，可利用这一特性激活药物释放。
其他响应系统
明胶和胶原蛋白除了具有酶和 pH 响应性外，还是热敏性材料，可用于开发温度敏感的微 / 纳米凝胶。在精确化学交联状态下，明胶微 / 纳米凝胶在低温下可形成半柔性、相对刚性的 “蠕虫状” 螺旋结构，随温度变化，这些螺旋结构可能转变为无序的无规卷曲，使聚合物链更具柔性，导致纳米颗粒溶胀或收缩。温度响应性药物释放还可由光热效应和近红外光触发。在临床应用中，近红外光可作用于光热材料（如金纳米棒）实现局部加热，引发药物释放。
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶若通过氧化还原或活性氧（ROS）敏感的连接剂交联，还可对氧化还原或 ROS 触发产生响应。例如，通过二硫键将小干扰 RNA 分子接枝到纳米凝胶上，在谷胱甘肽存在下，二硫键断裂，可实现功能性小干扰 RNA 分子的可逆释放；ROS 敏感的胶原蛋白 - 聚（硫醚）微凝胶，在 ROS 作用下，聚（丙烯砜）被氧化，硫键转化为亲水性砜，使材料溶胀并释放药物 。
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶递送系统的应用
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶结构多样，且具有环境响应性药物释放特性，在从组织再生到癌症治疗和诊断等众多治疗领域都有广泛应用。
骨修复
骨骼疾病发病率不断上升，骨修复成为医学领域的研究热点。骨缺损修复通常需要持续的药物释放，基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶在损伤部位原位注射后，可持续释放活性物质，实现骨组织修复和再生。胶原蛋白基微球主要用于将干细胞或大型细胞因子移植到体内，为干细胞生长、增殖和向成骨细胞分化提供平台。
除了干细胞，细胞因子也可通过水凝胶递送至体内，调节细胞促进骨组织修复。将骨形态发生蛋白 2 和血管内皮生长因子掺入微球中，前者缓慢释放，促进骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和矿化率增加，推动骨组织再生；后者快速释放，使血管长度增加，加速血管再生 。
小分子药物如地塞米松，也能促进祖细胞分化修复骨组织。地塞米松负载的明胶纳米颗粒，初期会爆发式释放一定量药物用于抗炎，随后以每天 20 ng 的低浓度持续释放 28 天，可显著提高成骨相关蛋白的表达水平，促进成骨分化。此外，明胶微球还可作为仿生润滑剂注入骨关节，释放药物缓解炎症，治疗骨关节炎 。
伤口愈合
伤口愈合是一个漫长且连续的过程，包括止血、炎症、增殖和重塑四个阶段，常伴随氧化应激或细菌感染，需要药物既能快速发挥抗菌作用，又能长期持续释放促进组织再生。基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶递送系统可通过调整结构和释放机制满足这一需求。
细胞活性物质能调节氧化应激和基质金属蛋白酶，加速伤口愈合。例如，负载 H8 巨噬细胞膜衍生纳米囊泡的明胶微球，可在伤口处因基质金属蛋白酶 9 过量而刺激纳米囊泡释放，降低局部活性氧水平，保护细胞免受氧化应激损伤和炎症影响，使伤口在 14 天的闭合率达到 92.08%，远高于对照组的 73.44% 。
负载小分子药物、合成聚合物和无机材料等活性成分的胶原蛋白衍生微 / 纳米凝胶也有助于伤口修复。如负载姜黄素的鱼鳞胶原蛋白 / 羟丙基甲基纤维素纳米凝胶，能在 20 天内促进伤口近乎完全愈合；负载 ε - 聚赖氨酸的明胶微球，对金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的杀灭率超 75%，同时促进成纤维细胞黏附 。
Zn2+作为安全材料，能提高抗炎细胞因子的表达，促进细胞生长和分化，加速组织修复，含锌材料还具有抗菌特性，有利于伤口愈合。嵌入 ZnO 纳米颗粒的胶原蛋白微凝胶在体外修复划痕伤口时，展现出更强的抗菌活性，促使更多细胞迁移到受伤区域，使伤口完全修复，而对照组在 72 h 时伤口愈合率仅为 27.35% 。
抗癌治疗
癌症是全球重大疾病负担，肿瘤细胞具有增强的通透性和滞留效应，且肿瘤微环境呈弱酸性、富含活性氧，具有 pH 响应和氧化还原响应特性的纳米递送系统在癌症治疗中疗效更佳。基于胶原蛋白及其水解产物可制备多种响应性纳米凝胶。
基于胶原蛋白的纳米凝胶可负载多种物质用于癌症治疗。例如，盐酸多柔比星是常用抗癌药物，胶原蛋白肽 - 壳聚糖纳米凝胶负载盐酸多柔比星后，对 HeLa 细胞的凋亡诱导率在 24 h 后高达 46%，对动物模型也有良好抗癌效果 。
近年来，癌症的主动靶向治疗研究广泛，修饰有仿生细胞膜的纳米颗粒作为新型药物递送系统潜力巨大。制备的负载盐酸多柔比星的癌细胞模拟纳米平台，静脉注射到小鼠肿瘤模型后，肿瘤部位的荧光强度在 12 h 后比单纯纳米凝胶注射组高约 1.47 倍，显著增强了靶向性能，14 天后肿瘤生长抑制率高达 70.36% 。
可视化
成像可视化可评估基于细胞的组织再生结果，观察组织缺陷的治疗情况，在再生医学领域应用广泛；也可用于病理组织的检测和检查。纳米尺寸的明胶水凝胶作为递送载体，可将荧光剂、造影剂等输送到治疗部位并实现实时可视化。
分子信标是能将基因表达转化为荧光信号的成像探针，可用于可视化活细胞中靶基因的表达。但分子信标与细胞膜之间存在负静电排斥，带阳离子的明胶纳米凝胶有助于分子信标内化，成为其理想载体。例如，制备的阳离子明胶纳米颗粒负载分子信标后，可用于可视化癌细胞中的自噬活性，其内化效率达 100%，远高于未封装的分子信标（44.7%） 。
造影剂在临床病理部位筛查中应用广泛，但有毒物质钆易在大脑中沉积产生毒性。1 - 20 nm 的纳米颗粒可快速经肾脏排出体外，不会通过血脑脊液屏障或渗漏的血脑屏障进入大脑。因此，安全、无毒、可生物降解的明胶纳米凝胶成为造影剂的理想基质。如将造影剂中的钆螯合到辐射交联的明胶纳米凝胶中，得到平均粒径 6 nm 的 Gd / 明胶纳米凝胶，其在 1 小时内即可快速经肾脏排出，降低了钆离子释放和在大脑中沉积的风险 。
挑战与展望
基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶具有高含水量、可调节的理化性质，尺寸可精确控制，比表面积大，内部网络结构利于载药，且富含反应性官能团，生物相容性和生物降解性良好，在生物医学领域应用前景广阔。然而，该领域仍面临一些挑战。首先，对胶原蛋白及其水解产物（如明胶）的概念存在混淆，材料描述中常将胶原蛋白水解产物误称为胶原蛋白，且制备过程中胶原蛋白易水解，影响最终产品结构。其次，胶原蛋白的来源和潜在免疫原性未得到充分重视，其动物源可能影响免疫反应，且微 / 纳米凝胶易被免疫系统识别，导致高清除率和药物提前释放。最后，实现基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶大规模生产并降低成本，对推进其临床应用至关重要，目前对药物释放后水凝胶的结构特征研究较少，影响对其释放曲线、生物分布和细胞相互作用的理解 。
未来，基于胶原蛋白的微 / 纳米凝胶药物递送系统研究和应用前景广阔。基于胶原蛋白的材料可与多种材料形成复合材料，开发出具有多种功能和多种刺激响应性的水凝胶，实现对疾病进展的实时监测和药物释放的动态调整，优化治疗效果。人工智能与基于胶原蛋白的材料相结合，有助于分析不同来源胶原蛋白的结构差异，优化微 / 纳米凝胶递送系统，且这些材料降解产生的生物活性小分子胶原蛋白肽可能有助于疾病治疗。此外，基于胶原蛋白的微米级水凝胶已在医疗器械中广泛应用，其在医疗器械领域的临床转化潜力巨大，但仍需进一步研究确保其安全性和在不同应用中的有效性 。
