揭秘人类 γ- 氨基丁酸转运体 3（GAT3）抑制的分子机制：为神经系统疾病治疗开辟新路径

为探究 GAT3 介导的 GABA 转运和抑制机制，研究人员测定人 GAT3 的冷冻电镜结构。结果发现 SNAP-5114 是非竞争性抑制剂，结合在 GAT3 的正位底物结合口袋。该研究为 GAT3 靶向药物设计提供框架。

　　在神秘的大脑世界里，γ- 氨基丁酸（GABA）就像一位重要的 “信使”，它是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，对中枢神经系统（CNS）的功能和成熟起着至关重要的作用。当神经元之间传递信号时，GABA 从突触小泡释放出来，与突触后膜上的受体结合，降低神经元触发动作电位的概率，从而维持神经信号传递的平衡。

然而，当 GABA 信号通路出现故障时，就像通信网络出了问题，一系列神经系统疾病便会接踵而至，如癫痫、自闭症、焦虑症和精神分裂症等。在这个过程中，γ- 氨基丁酸转运体（GATs）扮演着关键角色，它负责将 GABA 从突触间隙清除，维持兴奋和抑制性神经传递之间的平衡。在哺乳动物体内，有四种依赖钠（Na⁺）和氯（Cl^-）的 GABA 转运体，其中 GAT3 主要负责将 GABA 从突触间隙转运到星形胶质细胞中，参与多种生理过程，包括中枢神经系统的成熟、神经炎症调节以及突触后 GABA 能信号传导中相位和紧张性 GABA 受体电流的调节 。而且，GAT3 的异常表达与多种疾病相关，其上调出现在精神分裂症、神经炎症和雷特综合征中，而下调则与抑郁症和酒精使用障碍有关 。因此，GAT3 成为了治疗神经系统疾病极具潜力的药物靶点。

尽管 GAT3 如此重要，但目前关于它的研究却存在诸多空白。一方面，现有的 GAT3 抑制剂选择性有限，难以满足研究和治疗的需求。另一方面，GAT3 介导 GABA 转运和抑制的具体分子机制仍然未知，这极大地阻碍了针对 GAT3 的药物研发。为了填补这些空白，来自美国南加州大学（University of Southern California）的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员采用了多种先进的技术方法来深入探究 GAT3 的奥秘。其中，冷冻电镜（cryo-EM）技术是关键手段之一，通过它研究人员能够解析人 GAT3 在无配体状态（apo form）以及与选择性抑制剂 SNAP-5114 结合状态下的结构，从而从分子层面直观地观察 GAT3 的形态和变化。此外，研究人员还运用了定点突变技术（mutagenesis），通过改变 GAT3 基因中的特定碱基，研究不同氨基酸残基对其功能的影响。同时，放射性配体摄取试验（radioligand uptake assays）则用于检测 GAT3 的转运活性以及抑制剂对其的抑制效果。

1. GAT3 的结构测定

研究人员最初尝试表达和纯化全长野生型人 GAT3（GAT3_WT），并利用冷冻电镜确定其结构，但未成功。随后，他们采用了一种基于基准标记的策略，通过在 GAT3 上嫁接果蝇多巴胺转运体（dDAT）的 Fab 9D5 识别表位，成功获得了可用于结构研究的蛋白（GAT3_EM）。实验表明，这种改造后的 GAT3 仍能正常转运 GABA，并且对 SNAP-5114 的抑制敏感性与野生型相近。最终，研究人员分别解析了 GAT3 与 SNAP-5114 结合状态下（GAT3_SNAP）以及无配体状态下（GAT3_Apo）的冷冻电镜结构，分辨率分别达到 3.42 ? 和 3.51 ? 。

2. GAT3 的结构特征

GAT3 整体结构由 12 个跨膜螺旋（TM）组成，呈现典型的 LeuT 折叠。与其他已解析结构的神经递质钠同向转运体（NSS）相比，GAT3 在 TM1 的胞质端和部分细胞外环（ECL）存在显著差异。其中，ECL4 中的 EL4a 螺旋段因与 TM1b 上的 Y81 发生空间位阻而解旋，形成了独特的构象。这种构象使得 ECL4 上的 E372 与 ECL2 上的 W207 和 ECL6 上的 Y540 形成氢键，参与细胞外门的关闭过程。同时，GAT3 的正位底物结合口袋由 TM1、TM3、TM6、TM7 和 TM8 等多个跨膜螺旋组成，口袋内具有负静电势，有利于结合带正电的 Na⁺离子和底物 GABA。此外，研究人员还通过结构比对确定了 GAT3 中可能的 Na⁺和 Cl^-结合位点，在 GAT3_Apo结构中虽未观察到 Na⁺密度，但清晰看到了 Cl^-的密度，其配位方式与 GAT1 相同 。

3. SNAP-5114 的结合位点

SNAP-5114 是一种对 GAT3 具有选择性抑制作用的尼哌丁酸衍生物。研究发现，它结合在 GAT3 的正位底物结合口袋中，并与转运体形成极性和疏水相互作用。其中，尼哌丁酸部分与 GAT1 中尼哌丁酸、GABA 和替加宾的结合位点相同，通过羧酸基团与转运体上的多个氨基酸残基相互作用。而其三个 4 - 甲氧基苯基部分则与 TM1a、TM2、TM6b、TM7 和 TM8 等跨膜螺旋上的残基形成极性和疏水相互作用。进一步研究发现，GAT3 与 GAT1 在正位口袋上存在四个不同的氨基酸残基（E66、C316、V413 和 C414），这些残基与 SNAP-5114 的疏水相互作用以及 GAT3 正位口袋较大的体积，共同决定了 SNAP-5114 对 GAT3 的选择性抑制作用 。

4. SNAP-5114 对 GAT3 的非竞争性抑制机制

通过 [³H]-GABA 动力学摄取实验，研究人员发现随着 SNAP-5114 浓度的增加，GAT3 转运 GABA 的最大反应速度（V_max）显著降低，而米氏常数（K_m）基本保持不变，这表明 SNAP-5114 对 GAT3 的抑制作用属于非竞争性抑制。研究人员推测了三种可能的抑制机制：一是 SNAP-5114 先结合在 GAT3 的外向开放构象上，然后迅速转变为内向开放构象；二是 SNAP-5114 直接穿过质膜，在细胞内与正位口袋结合；三是上述两种机制的结合。综合考虑，研究人员认为最有可能的是第一种机制，即 SNAP-5114 与 Na⁺和 Cl^-离子一起结合到外向开放的 GAT3 上，随后 GAT3 通过中间的闭塞状态转变为内向开放构象，此时 Na⁺离子释放到细胞质中，而 SNAP-5114 和 Cl^-仍然结合在转运体上，使 GAT3 停滞在内向开放状态，从而非竞争性地抑制 GABA 的转运 。

这项研究首次解析了人 GAT3 的冷冻电镜结构，揭示了其在无配体和与抑制剂结合状态下的分子特征，明确了 SNAP-5114 对 GAT3 的非竞争性抑制机制以及选择性抑制的结构基础。这些成果为深入理解 GAT3 的功能和作用机制提供了重要依据，为开发针对 GAT3 的特异性药物奠定了坚实的结构基础，有望推动神经系统疾病治疗领域的新进展。不过，该研究也存在一定局限性，如未能成功获得与 Isatin 结合的 GAT3 结构，且无法完全排除 9D5 Fab 对 GAT3 构象的影响，未来还需要进一步的研究加以完善。