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为探究人细胞质前 60S 成熟机制，研究人员聚焦 SPATA5 复合物开展研究。他们发现 SPATA5 与 SPATA5L1、C1orf109、CINP 形成 4:2:2:2 复合物，解析其结构并明确与前 60S 结合模式，为理解核糖体生物发生提供结构基础。
在微观的细胞世界里，核糖体的生物发生就像一场精密而复杂的交响乐演奏。真核生物的核糖体生物发生是一个耗能巨大的过程，涉及 200 多个装配因子和大约 80 个 snoRNAs，众多能量消耗酶参与其中，ATPases 就是其中重要的 “演奏者”。在酵母中，AAA
+蛋白 Drg1 能从刚输出到细胞质的前 60S 颗粒中释放装配因子 Rlp24，这个过程对于前 60S 颗粒在细胞质中的最终成熟至关重要。然而在人类细胞中，类似的过程涉及 SPATA5（Drg1 的同源物）和其他额外因子，但具体机制却一直是个未解之谜。由于核糖体装配在从酵母到人类的进化过程中虽有保守性，但人类的过程更为复杂，还存在许多物种特异性特征。为了揭开这些神秘的面纱，北京大学的研究人员展开了深入的研究。
研究人员通过一系列实验，获得了 SPATA5 复合物的高分辨率结构以及内源性前 60S 复合物与 SPATA5 复合物结合的结构。研究发现，SPATA5 与 SPATA5L1、C1orf109 和 CINP 形成了稳定的 4:2:2:2 复合物，该复合物具有独特的结构特征，其 N 端环由 C1orf109、CINP 和 SPATA5/SPATA5L1 的 NTDs 组成，还有两个六聚体 AAA+ ATPase 环。令人惊讶的是，SPATA5 的 P 环中保守的半胱氨酸 C672 发生了亚磺酰化修饰，导致其 ATP 酶活性失活。而且，与酵母不同，人类细胞中前 60S 颗粒与 SPATA5 复合物的识别是由人类特异性因子 CINP 介导的，通过与 GTPBP4 和 ES27A 的两组不同相互作用实现。这些发现为理解细胞质前 60S 的成熟提供了结构基础，揭示了人类特异性特征，有望为相关治疗提供新的靶点和思路。该研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是冷冻电镜技术（cryo-EM），这一技术就像为研究人员提供了一台微观世界的 “超级显微镜”，让他们能够直接观察到 SPATA5 复合物以及它与前 60S 颗粒结合的精细结构。其次是免疫沉淀（Co-IP）技术，利用该技术验证了蛋白质之间的相互作用，如同在复杂的蛋白质网络中找到了连接各个节点的 “线索”。此外，研究人员还使用了 CRISPR/Cas9 技术构建细胞系，对基因进行精准编辑，从而深入探究基因功能。
SPATA5、SPATA5L1、C1orf109 和 CINP 组装成稳定复合物
研究人员分别在 HEK293T 细胞中测试这些蛋白的表达，发现野生型 SPATA5 表达水平低，而其 Walker B 突变体形式表达较好。进一步的共表达测试表明，这些蛋白共同表达时，SPATA5L1 与特定突变体共表达可提高表达水平，C1orf109 和 CINP 之间也存在相互促进表达的关系。通过大小排阻色谱（SEC）和负染色电子显微镜（nsEM）分析发现，只有当 SPATA52EQ、SPATA5L1、CINP 和 C1orf109 共同表达时，才能形成稳定的复合物，且该复合物具有典型的 AAA+ ATPases 六聚体环结构。同时，研究人员还发现突变的 SPATA5 复合物可能被困在前 60S 颗粒上，导致 RLP24 解离缺陷和核糖体组装异常。
SPATA5 复合物的结构组织
利用冷冻电镜对 SPATA5 复合物进行分析，最初获得了整体复合物的密度图，分辨率为 3.8 ?。由于 NTD 环和 D1 环之间连接灵活，研究人员分别对 NTD 环和 D1/D2 环进行局部优化，使分辨率分别提升到 3.4 ? 和 3.5 ?。SPATA5 复合物高度约 141 ?，宽度约 133 ?，由 SPATA5、SPATA5L1、C1orf109 和 CINP 按 4:2:2:2 的化学计量比组成。从顶部看，C1orf109 - CINP 异二聚体呈特定排列方式，多个蛋白的 NTD 相互作用形成漏斗状结构，CINP 和 C1orf109 可能作为衔接蛋白介导 SPATA5/5L1 六聚体与底物的相互作用。此外，研究人员还发现许多与疾病相关的突变位于 NTD 环的亚基界面，这表明该环在复合物的生理功能中起着关键作用。
SPATA5 复合物的独特结构特征及 SPATA5 和 SPATA5L1 的功能分化
SPATA5 和 SPATA5L1 以 4:2 的比例构成六聚体，这在其他 AAA+ ATPase 六聚体中尚未有报道。该复合物在不同轴向位置呈现不同结构，NTD 环呈方形，D1 环呈六边形，D2 环呈拉长六边形。SPATA5 和 SPATA5L1 的孔环（PL-I）存在差异，暗示它们在底物处理功能上有所分化。研究 ATP 结合位点发现，D1 环的六个 ATP 酶位点虽都被 ATP 占据，但处于不同活性状态。体外 ATP 水解实验表明，ATP 酶活性依赖于底物，且 SPATA5 的 D2 ATP 酶中心对复合物解离 RLP24 的功能更为重要。
SPATA5 的 P 环半胱氨酸残基氧化修饰使其 ATP 酶活性失活
研究发现 SPATA5 的 D2 结构域中，只有两个 SPATA5L1 亚基呈现 ATP 结合状态，SPATA5 的 ATP 结合 P 环折叠方式与 ATP 结合不相容。进一步研究发现，SPATA5 的 P 环中半胱氨酸 C672 发生亚磺酰化修饰，质谱分析显示几乎所有 SPATA5 蛋白在该位点都发生了这种修饰，在体内也检测到了这种修饰，且修饰水平约为 70%。这种修饰导致 P 环构象改变，影响 ATP 结合，进而使 D2 环结构改变，这揭示了一种可能普遍存在于 AAA+ ATPases 中的调节机制。
与突变 SPATA5 复合物共纯化的前 60S 颗粒的结构
对与突变 SPATA5 复合物共纯化的核糖体样颗粒进行冷冻电镜分析，发现这些颗粒是大亚基组装中间体，存在两种主要状态，这表明它们是细胞质前 60S 颗粒。虽然 SPATA5 复合物在最终密度图中未稳定解析，但 nsEM 图像显示存在许多结合的前 60S 颗粒，说明 SPATA5 复合物参与了细胞质前 60S 颗粒的成熟过程。
PA2G4 稳定 ES27A 并促进 SPATA5 复合物在前 60S 颗粒上的稳定
酵母中 Drg1 通过与 Arx1 和 ES27 直接相互作用结合前 60S 颗粒，研究人员推测其人类同源物 PA2G4 可能也有类似作用。由于 PA2G4 对维持 ES27A 稳定很重要，研究人员在冷冻样品制备前添加过量重组 PA2G4 蛋白，结果成功解析出 PA2G4 和 SPATA5 复合物密度相对稳定的前 60S 颗粒结构，这表明 PA2G4 可通过稳定 ES27A 间接稳定 SPATA5 复合物。
CINP 和 C1orf109 是 SPATA5 复合物的衔接蛋白
与酵母前 60S - Drg1 复合物结构对比，发现 SPATA5 复合物在前 60S 颗粒上的取向有很大不同。SPATA5 复合物与前 60S 颗粒有两个结合界面，一个是 CINP 与 GTPBP4 的蛋白界面，另一个是 ES27A 与 SPATA5 复合物 NTD 环的界面。免疫沉淀实验和交联质谱验证了这些相互作用，表明 CINP 和 C1orf109 是介导 SPATA5 复合物与底物 RLP24 相互作用的衔接蛋白。
研究表明，SPATA5、SPATA5L1、C1orf109 和 CINP 形成的复合物在核糖体组装中发挥着重要作用，它们共同促进细胞质中 RLP24 的释放。与酵母相比，人类细胞中 SPATA5 复合物的招募方式不同，涉及更多的衔接蛋白，这可能与 RLP24 的进化有关。对 SPATA5/5L1 致病突变的分析揭示了 NTD 环在复合物组装和功能中的重要性。此外，SPATA5 的 C672 位点的亚磺酰化修饰可能是一种可逆的调节方式，为研究 SPATA5 复合物的调控机制提供了新方向。该研究为理解人类核糖体生物发生提供了重要的结构和功能信息，也为相关疾病的治疗提供了潜在的靶点和理论基础。
