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帕金森病（PD）等神经退行性疾病与 α- 突触核蛋白（α-syn）原纤维密切相关。研究人员针对 α-syn N 端截断体（66–140）开展研究，确定了 K80、E83、K96 和 K97 等关键带电残基在原纤维形成中的作用，为相关疾病治疗提供新靶点。
在神秘的大脑世界里，帕金森病（PD）如同一个隐藏的 “杀手”，悄然威胁着人们的健康。目前，科学界已经知道 α- 突触核蛋白（α-syn）原纤维的大量存在是帕金森病、多系统萎缩（MSA）和路易体痴呆等疾病的病理标志。然而，α-syn 原纤维具有高度的多态性，其形成机制在残基水平上却依旧迷雾重重。究竟是什么因素导致了这些原纤维呈现出不同的形态和结构？这一问题成为了神经科学领域亟待攻克的难题。因为弄清楚 α-syn 原纤维多态性的分子起源，对于揭示淀粉样蛋白结构与疾病之间的关系至关重要，也可能为开发针对这些神经退行性疾病的有效治疗方法指明方向。
为了揭开这层神秘的面纱，来自美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）多个研究所的研究人员踏上了探索之旅。他们将目光聚焦在 α-syn 的 N 端截断体（66–140）上，开展了一系列深入研究。最终，他们成功界定了 α-syn N 端截断体原纤维形成中关键的带电残基，为理解 α-syn 聚集机制和相关疾病的治疗干预提供了关键线索，研究成果发表在《Nature Communications》上。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：
- 质谱技术：通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析，鉴定 α-syn 在溶酶体作用下产生的肽片段，确定 66–140 的来源。
- 光谱技术：利用硫代黄素 T（ThT）荧光测定法监测 α-syn 的聚集动力学；采用拉曼光谱和固态核磁共振（ssNMR）光谱技术对原纤维结构进行表征。
- 显微镜技术：借助透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察原纤维的形态。
- 分子动力学模拟：通过构建模型进行分子动力学模拟，进一步探究带电残基之间的相互作用。
下面我们来详细了解一下研究结果：
- 66–140 的起源：研究人员利用纯化的小鼠脑溶酶体，通过 LC-MS 分析 α-syn 的降解产物。结果发现，溶酶体能够从可溶性 α-syn 产生 66–140，且只有天冬酰胺内肽酶（AEP）可以特异性地在 N65/V66 位点切割可溶性 α-syn 生成 66–140。此外，随着小鼠年龄增长，溶酶体蛋白酶活性增强，这表明年龄可能影响 α-syn 截断体的产生，暗示了 66–140 与疾病的潜在关联。
- 66–140 原纤维的形成：通过 ThT 荧光监测 66–140 的聚集动力学，发现与全长 Ac1–140 相比，66–140 的聚集速度更快。改变溶液离子强度会影响其聚集速度，且自种实验证实了其成核 - 聚合机制。TEM 和 AFM 图像显示，66–140 原纤维主要为扭曲状，宽度约 10nm，高度约 7nm，与全长蛋白原纤维结构存在差异。拉曼光谱和 ssNMR 实验进一步表明，66–140 原纤维具有更有序的结构，其二级结构主要为 β - 折叠。
- 电荷中和对聚集动力学的位点特异性影响：研究人员构建了多个 66–140 单丙氨酸突变体，研究单个带电残基在原纤维成核和生长中的作用。结果显示，核心位置的 K80 和 E83 突变对聚集动力学影响显著，而无序区域的 D98 和 K102 突变影响较小。E83A 突变加速聚集，K80A 和 K97A 突变则延长聚集时间。
- K80 和 E83 电荷去除对原纤维形态的影响：TEM 和 AFM 图像显示，K80A 原纤维形态异质性高，E83A 原纤维主要为直纤维。拉曼光谱分析表明，K80A 和 E83A 原纤维在酰胺 I、酰胺 III 和指纹区光谱特征与 66–140 存在差异，进一步证实了这两个残基在确定 66–140 淀粉样结构中的关键作用。
- K80、E83 和 K97 是原纤维传播的关键残基：交叉种子实验表明，K80、E83 和 K97 对 66–140 原纤维传播至关重要。K96A 和 K97A 突变影响原纤维产量和聚集动力学，双突变 K96A/K97A 完全抑制原纤维形成。K80A 和 E83A 突变显著降低原纤维交叉种子能力，拉曼光谱显示交叉种子后突变体原纤维结构发生变化，进一步验证了这些残基在原纤维生长中的重要性。
- 66–140 原纤维结构中 E83–K97 盐桥的提出：通过测试电荷开关突变体与 66–140 原纤维的交叉种子兼容性，研究人员发现只有 E83K/K97E 突变体能够被 66–140 原纤维引发聚集，TEM 和拉曼光谱结果也证实了这一点。分子动力学模拟表明，只有 K97 与 E83 能形成盐桥，支持了 E83–K97 盐桥在原纤维传播中的存在和必要性。
- C 末端赖氨酸电荷中和对 Ac1–140 聚集的影响：研究人员对乙酰化全长蛋白 Ac1–140 进行单 K-to-A 突变研究，发现 K80A、K96A 和 K97A 突变均显著影响其聚集动力学和原纤维形态。交叉种子实验表明，这些突变体原纤维与野生型原纤维的结构和兼容性存在差异，进一步验证了 66–140 作为研究 α-syn 原纤维形成模型的有效性。
综合上述研究结果，研究人员通过对溶酶体来源的 α-syn N 端截断体 66–140 的研究，确定了多个关键带电残基在原纤维形成中的重要作用。这些残基通过影响聚集动力学、原纤维形态和传播效率，参与了 α-syn 原纤维的形成过程。研究还发现 E83–K97 盐桥对原纤维传播至关重要，拓展了对 α-syn 原纤维盐桥结构的认识。
在讨论部分，研究人员指出，66–140 源自可溶性 α-syn 经溶酶体 AEP 的蛋白水解作用，这再次强调了溶酶体功能在产生淀粉样 α-syn 变体中的作用，暗示调节溶酶体活性可能是调节 α-syn 稳态的一种策略。此外，研究结果表明 66–140 是研究 α-syn 原纤维形成的有用模型，为进一步研究 α-syn 聚集机制提供了重要参考。
这项研究的重要意义在于，它为理解 α-syn 原纤维多态性的分子机制提供了新的视角，明确了关键带电残基在原纤维形成中的作用，为开发针对帕金森病等神经退行性疾病的治疗方法提供了潜在的靶点。未来的研究可以在此基础上，进一步探究这些关键残基在患者来源的原纤维中的作用，以及静电相互作用在其他淀粉样蛋白中的机制，有望为攻克这些难治性疾病带来新的希望。
