基于滚环扩增G43长纳米线反向信号检测碱性磷酸酶的高灵敏度新策略

本研究针对临床重要标志物碱性磷酸酶（ALP）检测灵敏度不足的问题，开发了基于滚环扩增（RCA）和G43长纳米线的荧光传感平台（RCA-LG）。通过ALP介导的5'端去磷酸化阻断RCA反应，结合物理分区设计，实现了1.0×10-6 U/mL的超敏检测，为疾病早期诊断和酶抑制剂筛选提供了新工具。

　　

碱性磷酸酶（ALP）作为生物体内关键的磷酸水解酶，其活性异常与肝胆疾病、骨代谢紊乱乃至多种癌症密切相关。然而传统检测方法面临灵敏度不足、操作复杂等瓶颈——常规荧光法依赖昂贵纳米材料，而基于p-硝基苯磷酸盐等底物的比色法难以检测痕量ALP。如何建立简便、高敏的ALP检测体系，成为临床诊断和基础研究的迫切需求。

重庆某研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表的研究中，巧妙利用滚环扩增技术（RCA）与DNA纳米结构的协同效应，开发了名为RCA-LG的创新检测平台。该技术通过ALP对DNA 5'磷酸基团的"分子剪刀"作用调控RCA反应开关，结合G43重复序列自组装形成的长纳米线信号放大系统，实现了ALP活性的超灵敏定量分析。

研究采用三项核心技术：1）靶向抑制RCA反应设计，通过ALP去除5'磷酸基团阻断T4 DNA连接酶的环化作用；2）G43串联重复序列的等温扩增，利用Phi29 DNA聚合酶生成可结合硫磺素T（ThT）的荧光纳米线；3）物理分区反应体系，将ALP去磷酸化与RCA扩增分置于PCR管盖与管底，通过离心触发级联反应，有效避免交叉污染。

【Results】
研究证实RCA-LG系统在2.5小时内可检测低至1.0×10^-6 U/mL的ALP，较传统方法灵敏度提升三个数量级。关键创新在于：1）首创将G43重复序列整合至RCA模板，其扩增产物与ThT结合产生的荧光强度远超普通G-四链体；2）开发"一步法RCA"技术，将连接与扩增反应整合，效率提升40%；3）通过空间隔离反应步骤，使临床样本检测回收率达97.3%-104.5%。

【Significance and Novelty】
该研究突破性地将RCA技术从核酸检测拓展至酶活性分析领域，其优势体现在：1）免除了繁琐的磷酸化修饰步骤；2）G43纳米线信号放大系统使检测限降低至飞摩尔级别；3）物理分区设计为复杂样本检测提供通用性方案。该策略不仅为ALP相关疾病诊断提供新工具，更为重要的是，其建立的"酶活性-RCA抑制"模型可推广至其他磷酸酶检测及抑制剂筛选领域。

讨论部分强调，RCA-LG系统成功解决了临床痕量ALP检测的三大难题：灵敏度不足、操作复杂性和样本基质干扰。特别值得注意的是，该方法对血清和尿液样本中ALP的检测变异系数<5%，显著优于现有商业试剂盒。研究者指出，未来通过优化G重复单元数量和开发多色荧光探针，有望实现多重磷酸酶谱分析，为精准医学提供新的技术路径。