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本文研究了植物促生根际细菌（PGPR）混合菌剂对害虫的防治效果及其对害虫肠道微生物群的影响。发现 PGPR 混合菌剂可抑制玉米穗虫和烟芽夜蛾幼虫生长，改变其肠道微生物群，为害虫可持续治理提供了新策略。
1. 研究背景
昆虫取食危害严重影响全球作物产量，给农民带来经济损失。化学农药是常用的防治手段，但存在诸多问题，如对生态环境有害、导致昆虫产生抗药性等。因此，开发新的环保害虫管理策略迫在眉睫。
植物促生根际细菌（PGPR）在促进植物生长、增强植物养分吸收、防治土壤病原体和抵御害虫等方面具有潜力。然而，PGPR 对昆虫肠道微生物组的影响尚不明确，而昆虫肠道微生物群在昆虫的多种生理过程中发挥着重要作用。
玉米穗虫（Helicoverpa zea）和烟芽夜蛾（Chloridea virescens）是美国玉米、棉花等作物上的重要害虫，难以防治。本研究旨在评估 PGPR 菌株混合菌剂对害虫的防治效果，并探究其对昆虫肠道微生物群的影响。研究假设为接种 PGPR 菌株的人工饲料会抑制害虫生长并降低其肠道微生物群的多样性。
2. 材料与方法
2.1. 菌株的收集与鉴定
研究共使用 8 种细菌菌株，包括 4 种 AP 菌株（来自奥本大学昆虫学和植物病理学系培养物保藏库）和 4 种 TC 菌株（从德克萨斯州 Panhandle 地区玉米根际分离）。通过特定方法对 TC 菌株进行分离、PCR 扩增、测序及鉴定，鉴定后将菌株保存于 - 80°C。
2.2. 处理列表与 PGPR 菌株混合菌剂的制备
实验设置 6 种处理，包括未处理对照、化学接触杀虫剂处理、3 种不同的 PGPR 菌株混合菌剂处理（Blend TX5、AU Blend 8、Blend TX6），其中一种处理因菌株不可用而设为空白。各菌株经培养、离心浓缩后，调整浓度至约 108菌落形成单位（CFU）/ml，制备混合菌剂。
2.3. 人工饲料的制备与 PGPR 混合菌剂接种
按照特定方法制备玉米穗虫人工饲料，分为未接种（Set A）和接种（Set B）两组。Set B 组在饲料冷却至 50°C 时，加入浓度为 1×108 cfu/ml 的细菌混合菌剂，使混合菌剂与饲料悬液体积比达到 10% v:v。
2.4. 用于发育生物测定的毛虫准备
从本宗研究公司（Benzon Research）购买玉米穗虫和烟芽夜蛾的卵，在实验室特定条件下培养。将 2 日龄的幼虫先在 Set A 人工饲料上饲养至 4 龄初期，再转移至 Set B 人工饲料上，以避免幼虫孵化后死亡率高对实验结果的干扰。
2.5. 幼虫接触接种人工饲料
4 龄初期的幼虫从标准未接种人工饲料（Set A）转移至接种了相应细菌混合菌剂的饲料（Set B）上，在室温下监测其生长发育。接种 7 天后测量幼虫体重，9 天后解剖部分幼虫收集肠道样本。
2.6. 植物培养与昆虫幼虫侵染
种植无腺体、非 Bt 棉花品种 COT 17 GLS 种子，待植株长至 3 叶期时，进行昆虫幼虫侵染实验。实验前，先将幼虫在未处理棉花植株上驯化，以减少转移应激导致的死亡。选择生长状况相似的植株，随机分配到各处理组，对植株叶片喷施细菌混合菌剂，干燥后接入 4 龄期的玉米穗虫幼虫，并用纱网袋覆盖叶片，限制幼虫活动范围，每天观察记录幼虫死亡率。
2.7. 幼虫解剖、肠道样本收集、微生物分离及 16S rRNA 测序
从接种饲料实验的各处理组中选取 3 只幼虫进行解剖，收集肠道内容物。一部分肠道内容物用于细菌分离，使用多种微生物生长培养基；另一部分保存于 - 20°C 备用。对分离得到的纯细菌菌株，通过扩增 16S rRNA 基因进行鉴定，测序后将结果在 EZBiocloud 数据库中比对，并将核苷酸序列提交至 GenBank。
2.8. 昆虫肠道样本的非培养分析
为更全面了解昆虫肠道微生物群，对之前保存于 - 20°C 的肠道内容物子样本进行非培养分析。提取基因组 DNA，经电泳、纳米滴度检测和 Qubit 定量后，使用特定引物对 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域进行测序，分析原始序列读数。
2.9. 统计与生物信息学分析
使用统计分析系统（SAS）软件对幼虫体重数据进行方差分析（ANOVA），采用 Tukey's Studentized Range 检验比较各处理组差异。对测序数据进行预处理和生物信息学分析，包括序列修剪、压缩、上传至高性能计算集群，通过 Mothur 1.48 MiSeq SOP 管道进行聚类和分类操作分类单元（OTU）分析，评估 α 和 β 多样性，将序列数据提交至 NCBI 的序列读数存档（SRA）数据库。
3. 结果
3.1. PGPR 接种人工饲料对幼虫发育的影响
化学对照处理下，所有幼虫在 4 - 24 小时内死亡。3 种细菌混合菌剂处理（Blend TX5、AU Blend 8、Blend TX6）均导致玉米穗虫和烟芽夜蛾幼虫生长延迟且显著减缓（p = 0.05）。接种 7 天后，玉米穗虫幼虫中，处理 6（Blend TX6）的平均体重显著低于未处理对照，但高于处理 3（Blend TX5）和处理 5（AU Blend 8）；烟芽夜蛾幼虫的生长趋势相似，但处理间绝对生长测量值存在细微差异。
接种 2 周后观察，化学对照处理下幼虫全部死亡；未处理对照中，两种昆虫均有 12.5% 的幼虫死亡，87.5% 的幼虫已化蛹或正在化蛹。微生物混合菌剂处理的幼虫死亡率在 12.5% - 50% 之间，12.5% - 75% 的幼虫化蛹，部分存活幼虫发育不良，难以化蛹。
3.2. 接种植物上幼虫的生长情况
未处理对照植物上幼虫死亡率为 16.6%，化学对照处理导致幼虫 100% 在 24 小时内死亡，而细菌混合菌剂处理（Blend TX5、AU Blend 8、Blend TX6）的死亡率分别为 83.3%、75%、75%。
3.3. 从幼虫肠道中鉴定的细菌菌株
从不同处理的玉米穗虫幼虫肠道中共纯化出 45 株细菌，主要为芽孢杆菌（Bacillus）及相关细菌。各处理组中分离出的菌株数量不同，且多数分离菌株未包含在实验所用的混合菌剂中，但部分与混合菌剂中的菌株或其近亲有关。
3.4. 各处理间肠道微生物群的多样性
测序共产生 1,132,062 个配对末端读数，平均每个样本 94,338 个读数。分类群相对丰度的堆叠柱图显示，处理 3 和处理 6 的微生物种群相似性较高，处理 5 中芽孢杆菌的相对丰度最高，但 α - 变形菌和 γ - 变形菌的相对丰度较低，未处理对照的微生物种群多样性最高。
香农均匀度分析表明，所有细菌混合菌剂处理的 H 值均较低，处理 3 的 H 值最低，反映出混合菌剂处理下微生物多样性较低、均匀度较高。加权 UniFrac 主成分分析显示，微生物混合菌剂处理的样本聚类和重叠现象明显，与未处理对照差异显著。通过观察分类群数量和 Chao1 指数评估物种丰富度，发现处理 1 和处理 6 的分布范围较处理 3 和处理 5 大，但经 Kruskal - Wallis 检验，差异不显著。
4. 讨论
本研究中 PGPR 混合菌剂抑制了玉米穗虫和烟芽夜蛾的生长发育，改变了玉米穗虫幼虫的肠道微生物种群。这表明，干扰幼虫发育和昆虫肠道微生物群的策略有望成为可持续、环保的综合害虫管理的重要组成部分。虽然 PGPR 影响植物 - 昆虫相互作用的机制尚不清楚，但本研究表明干扰昆虫肠道微生物群是 PGPR 减少昆虫取食危害的重要机制之一。
使用多种菌株混合可能是本研究处理成功率高的原因。不同 PGPR 菌株单独或混合使用在作物生产和害虫管理中均有一定效果，但也存在结果不一致的问题。本研究通过策略性选择和组合菌株，制备混合菌剂，并采用新的叶片喷施方法，提高了 PGPR 的适应性、存活率、功效和稳定性。
玉米穗虫和烟芽夜蛾是密切相关的经济害虫，对化学杀虫剂的耐受性和抗性发展存在差异。与化学杀虫剂类似，PGPR 的应用时机至关重要，若错过关键喷施时期，会降低其防治效果；但如果正确应用，PGPR 有望帮助克服昆虫对化学药剂的抗性。本研究在实验室和生长室条件下获得的结果，其方法具有实际田间应用的潜力。
培养依赖和非培养方法的结果基本一致，均显示芽孢杆菌在肠道微生物群中占主导地位，同时存在大量 γ - 变形菌。多数回收菌株为肠道内的固有微生物，接种混合菌剂处理后微生物种群发生了显著变化，这些变化对昆虫活动具有重要影响。
目前，虽然对肠道微生物群变化的细节尚不清楚，但 PGPR 可调节昆虫肠道、健康和行为的发现，为设计可持续的生物防治策略提供了重要依据。本研究也提出了新的问题，如 PGPR 对成虫羽化、繁殖力的影响，以及对后代性别比例、生殖效率和多代肠道微生物群的影响等，有待进一步研究。有效利用 PGPR 管理昆虫种群，有望减少对合成农药的依赖，具有积极的生态意义。
