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本文聚焦于流式细胞术（FCM）在保护濒危植物方面的应用。研究发现 FCM 能有效检测植物杂交风险，通过分析多对植物物种，证实其在识别潜在杂种上的价值。同时探讨了该技术的优势、局限及应对策略，为植物保护提供重要参考。
流式细胞术在保护中的应用：检测濒危植物物种的杂交风险
杂交在生物进化中扮演着重要角色，约 25% 的植物类群会与至少一种其他物种杂交，30 - 70% 的植物物种在进化历史中经历过杂交事件。杂交可以促进物种形成和适应性辐射，但也可能对物种的适应性、生存和生物多样性构成威胁，尤其是对于稀有、濒危的植物物种，可能导致遗传和人口统计学上的 “淹没”，甚至灭绝。
传统上，识别杂种主要依靠其与亲本物种相比的中间形态，但这种方法存在局限性，因为形态中间性可能由多种因素导致，并非杂交所特有。分子遗传技术虽能更准确地研究杂交，但存在数据处理复杂、成本高等问题。而流式细胞术（FCM）作为一种快速、有效且非破坏性的工具，在植物科学研究中得到广泛应用，可用于检测杂交和基因渗入，为濒危植物保护提供有价值的信息。
材料和方法
研究选取了捷克共和国和斯洛伐克的 13 对疑似杂交的植物物种，涵盖同源多倍体和异源多倍体系统。这些物种对中，至少有一种在当地处于受威胁状态，另一种分布相对广泛。研究旨在通过 FCM 分析这些物种的相对和绝对基因组大小，以评估杂交情况。
在实验过程中，仅使用新鲜、完整的叶片组织样本（采集后最长 48 小时内）进行 FCM 分析。采用 DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）染色和碘化丙啶（PI）染色，使用不同的流式细胞仪进行检测。实验遵循简化的两步协议，选择与样本基因组大小接近且不与样本峰重叠的内部参考标准，如Carex acutiformis（0.818 pg，用于Cardamine）、Solanum pseudocapsicum（2.414 pg，用于Juncus、Pilosella）等。
具体操作时，将约一平方厘米的叶片组织与内部参考标准一起用剃须刀在含有冰冷缓冲液 Otto I 的塑料培养皿中切碎，过滤后用缓冲液 Otto II 染色。对于部分属（如Epilobium、Pilosella、Potamogeton和Ranunculus），使用 PI 染色并优化了方法。通过 Partec FloMax 软件评估基于 5000 个染色细胞核的直方图，仅考虑具有对称峰且样本 G1 峰变异系数（CV）低于 5% 的直方图。为区分异源多倍体杂交和由未减数配子产生的植物，计算了异源多倍体杂种和 2n + n 个体的理论值。
结果
分析结果证实了 14 对模型分类群及其亲本物种之间相对和绝对基因组（RGS 和 AGS）大小的差异，仅Dactylorhiza bohemica存在一个单一纯物种（D. majalis）的情况除外。
在异源多倍体模型系统对（如Aconitum、Cardamine、Juncus、Pilosella、Ranunculus、Urtica）中，观察到过渡细胞型的存在。例如，在涉及二倍体和四倍体亲本的组合中，发现了类似 DNA 三倍体的奇数倍性水平细胞型；在Cardamine中，可能鉴定出源自十倍体C. enneaphyllos（5x）和六倍体C. glanduligera（3x）的减数配子的 DNA 八倍体细胞型。通过比较过渡细胞型的 RGS 和 AGS 与理论值，可对其来源进行分类，部分案例支持杂交起源，但在Aconitum中存在不确定性。
在同源多倍体分类群对（如Dactylorhiza、Epilobium、Potamogeton、Pulsatilla以及二倍体Urtica dioica和U. kioviensis）的分析中，也鉴定出了基因组大小在亲本之间呈连续变化的过渡细胞型。
讨论
增强植物保护策略：利用流式细胞术快速检测异源多倍体和同源多倍体杂交
研究结果表明，FCM 不仅适用于传统科学研究，还能快速识别杂种，为濒危植物的保护策略提供有力支持。FCM 数据的解释受亲本分类群基因组大小差异和倍性水平的影响。在异源多倍体杂交中，通常会形成具有奇数倍性水平的中间或过渡细胞型，这在研究的多个异源多倍体系统中得到证实。然而，过渡细胞型也可能由同一分类群中减数和未减数配子的融合产生，如在Aconitum的案例中，准确判断其起源需要遗传数据。
区分过渡细胞型的起源对于制定有效的保护策略至关重要。由单一亲本配子融合产生的过渡细胞型通常在种群中数量较少，对进化和种群动态影响较小；而杂交产生的过渡细胞型可能会导致基因流动和渗入，威胁亲本分类群的遗传独特性，甚至导致遗传 “淹没”。通过分析基因组大小的定量组成，可在一定程度上区分这两种起源。
此外，杂交产生的过渡细胞型通常在形态上与亲本分类群相似，这为其杂交起源提供了支持。但在某些情况下，当亲本物种在形态和细胞学上相似时，区分杂种和由未减数配子产生的个体可能会变得困难。
在同源多倍体杂交中，基因组大小的差异主要源于非编码重复 DNA 成分的增减。由于同源多倍体杂种通常具有较高的育性，可能会与亲本回交并形成杂交群，这给区分亲本物种和杂种带来了挑战。在研究Urtica kioviensis和二倍体U. dioica的杂交区域时发现，杂交可能伴随着频繁的基因渗入，对U. kioviensis这一濒危物种构成威胁。同时，连续的基因组大小值可能由多种因素导致，在分析时需要排除 FCM 的潜在误差。
总体而言，研究中过渡细胞型的出现频率较低，但由于采样设计的局限性，无法确定杂交在模型系统接触区的实际作用，需要更严格的采样来评估杂种细胞型对受影响种群的威胁程度。
为保护目的使用流式细胞术检测杂种的关键考虑因素：优势和挑战
在使用 FCM 进行杂种筛选和相关研究时，需要考虑多个方面。技术协议方面，要严格遵循既定的指南和最佳实践建议，包括样本制备的湿实验室协议、选择合适的标准以及确保高质量的测量。湿实验室数据处理可能会受到次生代谢物的干扰，这些物质会与染色质和蛋白质结合，影响核染料的染色强度，可通过选择不含次生代谢物的器官或改进协议来解决。
对研究分类群的细胞学特征有深入了解至关重要。在研究前，需要知道其倍性水平、染色体数和已发表的基因组大小数据等。可通过查阅相关数据库（如植物染色体数索引 IPCN、染色体计数数据库 CCDB、植物 DNA C 值数据库等）获取这些信息。若缺乏这些数据，则需与细胞学分析专家合作生成。
一般认为，亲本物种之间 DNA 含量至少有 7% 的差异才能明确检测到杂种，但这需要高精度的测量。在同源多倍体杂交中，一些密切相关且易杂交的物种基因组大小相近，此时传统的遗传标记可能是更可行的检测杂种的方法。
采样设计也是关键因素。建议分析来自杂种群体（包括亲本和杂种）以及至少一个亲本物种 “纯” 群体的个体，以准确识别亲本的基因组大小并区分杂种。当杂种群体中缺少一个亲本或亲本基因组被同化时，获取缺失亲本的基因组大小信息至关重要。
最后，流式细胞仪的成本较高，可能限制了其在自然保护组织中的应用。但通过科研机构之间的合作，可以共享设备和专业知识，降低成本，促进杂交研究的发展。
结论
近几十年来，FCM 已成为研究植物各种核型、基因组和生殖方面的有力工具。在保护濒危植物方面，FCM 通过检测核 DNA 含量差异识别杂种的能力具有重要价值。虽然确定杂交通常需要其他方法（如形态学和分子遗传学方法）的佐证，但 FCM 可作为初步检测潜在杂种的首选方法。考虑到人类活动和全球气候变化导致的杂交风险增加，鼓励专业植物学家，尤其是保护主义者，重视 FCM 在快速识别植物杂交事件中的作用，以加强濒危植物的保护工作。
