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肝细胞癌（HCC）是肝脏主要恶性肿瘤，肝硬化是其重要风险因素。研究人员开展了关于肝硬化背景下 circRNA 对 HCC 调控的研究，发现 circCEP70 可抑制 HCC 进展，为 HCC 研究和治疗提供新方向。
在人体的微观世界里，肝脏就像一座繁忙的 “化工厂”，时刻进行着各种复杂的生理活动。然而，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）却如同潜伏在这座 “工厂” 里的 “破坏者”，严重威胁着人们的健康。HCC 是肝脏中最常见的恶性肿瘤，约占原发性肝癌的 80%，也是癌症相关死亡的主要原因之一。它的高发病率、高侵袭性和高复发率，给社会带来了沉重的负担。
肝硬化，作为 HCC 的一个重要风险因素，一直备受关注。在肝硬化的微环境中，肿瘤的发生和发展过程变得更加复杂。以往的研究发现，肝硬化微环境中的成纤维细胞具有异质性，有些能促进肿瘤发展，而有些则具有抑制肿瘤的作用。例如，表达 prolargin 蛋白的特定成纤维细胞亚群就展现出了肿瘤抑制活性，肌成纤维样癌相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts，CAFs）也能通过分泌 I 型胶原蛋白限制肿瘤转移。此外，临床研究还表明，有肝硬化基础的 HCC 患者早期肿瘤转移的发生率相对较低。但目前，对于肝硬化背景下 HCC 中环状 RNA（circular RNA，circRNA）的调控机制，我们还知之甚少。
circRNA 是一类特殊的非编码 RNA，它们通过转录过程中的共价键结合形成单链闭环结构。近年来，研究发现 circRNA 广泛参与各种生理和病理过程，在肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等方面都发挥着重要作用。基于此，四川大学华西医院的研究人员敏锐地意识到探索 circRNA 在肝硬化微环境中对 HCC 生物学行为的调控机制具有重要意义，这可能为 HCC 的研究和治疗提供新的思路和靶点。于是，他们开展了一系列深入研究，并将成果发表在了《Cellular and Molecular Life Sciences》上。
研究人员为了探究这一复杂的调控机制，运用了多种关键技术方法。他们收集了四川大学华西医院的 145 例 HCC 样本（其中 62 例肿瘤组织伴有相应正常组织） ，进行高通量 circRNA 测序以筛选差异表达的 circRNA。同时，构建裸鼠模型，在体内研究相关分子的功能。此外，还利用了 RNA 免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）等技术，从分子水平深入分析各个因素之间的相互作用和调控关系。
研究结果主要如下：
- circCEP70 的表达特征：研究人员通过 circRNA 测序发现，与正常肝脏背景的 HCC 组织相比，肝硬化背景的 HCC 样本中有 180 种 circRNA 显著下调，213 种显著上调。在差异表达的 circRNA 中，circCEP70 在肝硬化 HCC 中高表达，且其高表达与患者更好的生存预后相关，低表达则是患者独立的预后风险因素。circCEP70 由 522 个碱基组成，是由 3 号染色体上 CEP70 基因的外显子 3、4、5、6 环化形成，其剪接位点经 Sanger 测序验证与理论序列一致。此外，核质分离和荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）实验表明 circCEP70 主要分布在细胞质中。
- U2AF2 对 circCEP70 的调控：研究发现 RNA 结合蛋白 U2AF2 可与 circCEP70 的侧翼内含子序列结合，进而调控其表达。通过数据库预测和实验验证，U2AF2 的 RNA 结合序列 UUUUUUUC 在 circCEP70 未成熟形式的上下游均有匹配位点。敲低 U2AF2 可使 circCEP70 表达上调，过表达 U2AF2 则使其表达下调，且在临床样本中二者表达呈负相关。
- circCEP70 编码蛋白的验证：通过生物信息学预测和实验验证，circCEP70 含有内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site，IRES）和开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），具备编码蛋白的条件。双荧光素酶报告实验证实了 circCEP70 的 IRES 序列具有活性。质谱分析发现了与预测的 CEP70-160aa 蛋白相匹配的肽段，定制抗体检测也进一步确认了 circCEP70 可编码 CEP70-160aa 蛋白，且该蛋白主要分布在细胞质中。
- circCEP70 抑制 HCC 进展的机制：体内外实验表明，敲低 circCEP70 可促进 HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达 circCEP70 则抑制这些过程。机制研究发现，CEP70-160aa 蛋白可与丙酮酸激酶 M2（Pyruvate Kinase M2，PKM2）结合，阻碍 PKM2 进入细胞核。PKM2 在细胞核中可磷酸化信号转导和转录激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3），激活 STAT3 通路调节肿瘤生物学行为。敲低 circCEP70 会增加核内 PKM2 水平和 STAT3 磷酸化，过表达 circCEP70 和 CEP70-160aa 则降低 STAT3 磷酸化。使用小分子化合物 Tepp-46 抑制 PKM2 核转位，可抑制肿瘤细胞增殖和迁移，逆转因敲低 circCEP70 导致的肿瘤细胞恶性行为增强。
在讨论部分，研究人员指出肿瘤微环境对肿瘤发生的调控是一个复杂且多面的过程。虽然微环境通常被认为会促进肿瘤生长，但也有证据表明它能抑制肿瘤增殖。在本研究中，circCEP70 在肝硬化微环境中发挥了抑制肿瘤发生和发展的作用。与以往研究不同，此次研究聚焦于有肝硬化和无肝硬化的肿瘤组织，筛选差异表达的 circRNA，为 HCC 的治疗提供了潜在的新靶点。此外，研究还证实了 circCEP70 主要通过编码的蛋白发挥生物学效应，而非分子海绵作用，同时验证了 AlphaFold 3 在预测蛋白 - 蛋白相互作用方面的有效性。
综上所述，该研究首次揭示了 circCEP70 在肝硬化背景下的 HCC 中作为负调控因子的重要作用。它的激活受 U2AF2 与侧翼内含子序列结合的调控，通过编码 CEP70-160aa 蛋白抑制 PKM2 核转位和 STAT3 磷酸化，进而抑制 HCC 的进展。这一研究成果不仅加深了我们对 circRNA 在肿瘤发生发展中作用机制的理解，更为 HCC 的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据，具有重要的科学意义和临床应用价值。未来，有望基于这些发现开发出更有效的 HCC 治疗策略，为众多患者带来新的希望。
