A single-cell and tissue-scale analysis suite resolves Mixl1’s role in heart development：单细胞与组织尺度解析 Mixl1 在心脏发育中的关键作用

在研究发育调控基因功能时，单细胞嵌合体研究存在解释困难等问题。研究人员开展了利用 COSICC 分析 T 和 Mixl1 基因敲除对胚胎发育影响的研究，发现 T 影响中间中胚层和肢体发育，Mixl1 影响心脏和中胚层相关组织发育，为发育生物学研究提供了新视角。

　　在生命科学领域，发育生物学一直是研究的热点。基因在胚胎发育过程中的作用至关重要，尤其是关键调控基因对细胞分化和组织器官形成的影响。然而，传统的基因功能研究方法存在诸多局限性。利用 CRISPR 基因敲除结合单细胞转录组分析，虽然成为理解基因功能的重要工具，但大规模解析胚胎中每个细胞类型里发育主控基因的分子作用，在技术上仍极具挑战性，相关研究也较为匮乏。此外，单细胞嵌合体研究虽强大，但存在采样偏差和其他技术因素干扰结果的问题，对敲除影响的系统评估困难重重。

为了解决这些问题，来自欧洲分子生物学实验室（EMBL）、剑桥大学等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们利用嵌合小鼠胚胎的单细胞分析技术，系统地探究关键发育调节因子 T/Brachyury 和 Mixl1 在原肠胚形成和早期器官发生过程中的敲除效应。该研究成果发表在《iScience》杂志上，为发育生物学领域带来了新的突破。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，通过对嵌合小鼠胚胎进行单细胞水平的转录组分析，获取细胞的基因表达信息。其次，他们开发了 COSICC（comparative analysis of single-cell RNA-sequencing data for complex cell populations）这一计算工具套件，专门用于分析复杂发育细胞群体中的扰动效应，并通过与对照实验对比，有效解决了单细胞嵌合体研究中的采样偏差和实验效应干扰问题。此外，研究人员还构建了嵌合小鼠胚胎模型，将突变细胞注入野生型胚胎，观察突变细胞的后代在胚胎发育过程中的变化 。

研究结果主要分为以下几个部分：

• COSICC 助力分析发育扰动：研究人员使用两个独立的嵌合数据集和一个对照实验数据集。通过 scRNA-seq 对嵌合胚胎进行分析，并结合早期发育的参考单细胞图谱，研究扰动对细胞多样化的影响。COSICC 分析框架从细胞类型或细胞组丰度（COSICC_DA_group）、谱系轨迹丰度（COSICC_DA_lineage）和沿谱系轨迹的发育延迟（COSICC_kinetics）三个方面评估敲除效应，同时解决了复杂系统扰动研究中的采样偏差和实验效应干扰问题，并且使用了扩展的小鼠原肠胚参考图谱，更全面地反映早期小鼠器官发生 。
• T 基因敲除对胚胎发育的影响：利用 COSICC 全面分析 T 基因敲除的影响，发现 T^-/-嵌合体中，突变细胞的体节中胚层、前体节中胚层、中间中胚层、脊索等细胞类型减少，神经中胚层祖细胞（NMPs）增多，同时多种中胚层衍生细胞类型也出现减少。在谱系轨迹层面，T^-/-细胞向多种细胞类型的轨迹显著减少，并且间充质和尿囊谱系发育延迟。进一步研究发现，T 基因敲除对中间中胚层细胞影响显著，可能通过调节 Osr1 表达影响肾脏发育相关的中间中胚层后衍生物；在肢体发育方面，T 基因敲除影响肢体中胚层发育，下调了 Cited1、Hoxc5 和 Myc 等关键基因 。
• Mixl1 基因敲除对胚胎发育的影响：研究人员构建 Mixl1^-/-嵌合小鼠胚胎并进行 scRNA-seq 分析，发现 Mixl1 敲除对侧板中胚层（LPM）及其衍生物影响广泛，心肌细胞、心外膜细胞和红细胞等细胞类型和谱系减少，LPM 和肢体中胚层增多。Mixl1 敲除还导致后肠和中肠完全缺失，前肠、肠管等部分缺失。在心外膜谱系发育中，出现发育延迟现象。此外，研究人员通过对间充质细胞类型进行亚聚类分析，发现 Mixl1 敲除影响了心脏相关祖细胞群体（JCF）程序的启动，进而影响心脏细胞类型的下游发育 。

研究结论和讨论部分指出，COSICC 这一计算工具套件具有重要意义。它不仅能够有效分析复杂扰动数据，还适用于多种研究场景，如嵌合类器官系统、CRISPR 或药物扰动实验等。通过对 T 和 Mixl1 基因敲除的研究，揭示了这两个转录因子在中胚层相关组织发育中的重要作用，为深入理解胚胎发育机制提供了关键线索。同时，研究也存在一定局限性，如对细胞数量有要求，部分细胞类型因敲除导致数量不足，影响了相关分析。但总体而言，该研究为后续探究这些主控基因在特定细胞类型发育中的分子作用奠定了基础，有望推动发育生物学领域的进一步发展，帮助人们更好地理解生命发育的奥秘。