TTK：膀胱癌治疗新靶点 —— 调控线粒体自噬与凋亡的关键激酶

膀胱癌（BC）预后差且晚期治疗手段有限。研究人员开展 TTK 蛋白激酶在膀胱癌中作用的研究，发现 TTK 在 BC 组织和细胞系中上调，通过调节 ULK1磷酸化和前体 mRNA 剪接促进线粒体自噬，抑制细胞凋亡。研究成果发表在《Cell Death & Differentiation》杂志上。

　　

膀胱癌是全球范围内的重大健康挑战，其发病率和死亡率较高。在 2023 年，膀胱癌成为男性中第四大常见恶性肿瘤，占新发癌症病例的 6%，并导致 4% 的癌症相关死亡 。大部分患者确诊时处于非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）阶段，但约 20% 的 NMIBC 患者会在两年内进展为肌肉浸润性膀胱癌（MIBC），即便接受治疗，仍有近 50% 的 MIBC 患者在五年内病情进展。目前，对于膀胱癌进展和侵袭的分子机制了解不足，这严重制约了治疗策略的改进。

为了深入探究膀胱癌的发病机制，寻找潜在的治疗靶点，华中科技大学同济医学院附属协和医院的研究人员开展了关于 TTK 蛋白激酶（TTK）在膀胱癌中作用的研究。研究发现，TTK 在膀胱癌组织和细胞系中显著上调，且与患者预后不良相关。该研究成果发表在《Cell Death & Differentiation》杂志上。

在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：一是收集临床样本，获取新鲜肿瘤样本和相邻非肿瘤组织用于后续检测；二是采用多种检测技术，如蛋白质免疫印迹法（Western blot analysis）检测蛋白表达水平、免疫组化（IHC）评估蛋白表达情况、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测基因表达量；三是进行细胞实验，包括构建稳定敲低或过表达 TTK 的细胞系、开展细胞增殖和凋亡等相关实验；四是利用体内肿瘤生长实验，将细胞接种到裸鼠体内观察肿瘤生长情况；五是借助高通量技术，如 RNA 测序（RNA-Seq）分析基因表达和剪接变化。

研究结果如下：

• TTK 在膀胱癌中高表达且与预后相关：通过对 TCGA BLCA 和 GSE13507 数据集的分析，发现膀胱癌组织中 TTK 表达显著高于正常组织。对患者预后评估显示，高表达 TTK 的患者预后较差。进一步检测发现，TTK 在多种膀胱癌（BC）细胞系中的 mRNA 和蛋白水平均高于正常膀胱上皮细胞系。这表明 TTK 高表达可能预示着 BC 患者预后不佳。

• TTK 促进 BC 细胞增殖并抑制凋亡：构建稳定敲低 TTK 的 RT-112 和 UM-UC-3 细胞系，通过 CCK-8、CFSE 染色、EdU 等实验表明，TTK 敲低显著抑制细胞增殖。同时，流式细胞术分析显示，TTK 敲低诱导细胞凋亡，增加细胞在 Sub-G₀和 G₂/M 期的比例。体内实验也证实，敲低 TTK 的肿瘤在裸鼠体内生长缓慢。此外，使用 TTK 抑制剂 CFI-402257 处理荷瘤小鼠，肿瘤体积减小，小鼠生存期延长，说明抑制 TTK 具有治疗 BC 的潜力。

• TTK 增强 BC 细胞线粒体自噬：基因集富集分析（GSEA）发现 TTK 表达与线粒体自噬水平正相关。透射电镜、mtKeima 报告基因实验、COX8-EGFP-mCherry 质粒成像等多种实验表明，TTK 敲低会损害线粒体自噬，导致受损线粒体积累、线粒体 DNA（mtDNA）水平升高、线粒体 - 溶酶体共定位减少以及自噬标记物 LC3B-II 表达降低等。相反，恢复 TTK 表达则能改善这些现象，说明 TTK 在促进线粒体自噬中发挥重要作用。

• TTK 通过促进线粒体自噬抑制 BC 细胞线粒体凋亡：当线粒体自噬受抑制时，受损线粒体积累，产生大量线粒体活性氧（mtROS），破坏线粒体膜电位，激活凋亡途径。实验显示，TTK 敲低后，mtROS 水平显著升高，线粒体膜电位降低，促凋亡蛋白表达增加，抗凋亡蛋白表达减少。而使用 mtROS 清除剂 Tempo 处理后，这些变化得到逆转，细胞凋亡和生长抑制情况得到缓解，表明 TTK 敲低通过抑制线粒体自噬、增加 mtROS 水平，促进 BC 细胞通过线粒体凋亡途径死亡。

• TTK 通过调节 ULK₁ Ser⁴⁷⁷磷酸化促进线粒体自噬：通过免疫沉淀 - 质谱（IP-MS）等实验，确定 ULK₁是 TTK 调节线粒体自噬的关键靶点。体外激酶实验表明，TTK 能直接磷酸化 ULK₁的 Ser⁴⁷⁷位点。突变 ULK₁的 Ser⁴⁷⁷位点会损害线粒体自噬，增加细胞凋亡。野生型 ULK₁则能挽救因 Ser⁴⁷⁷突变导致的线粒体自噬抑制和细胞凋亡增加，说明 TTK 通过磷酸化 ULK₁的 Ser⁴⁷⁷位点，激活 ULK₁/FUNDC₁介导的线粒体自噬途径，抑制 BC 细胞线粒体凋亡。

• TTK 抑制促进 ULK₁外显子 5 跳跃和无义介导的 mRNA 降解（NMD）：研究发现，TTK 敲低不仅降低 ULK₁蛋白表达，还减少其 mRNA 水平。RNA-Seq 和 RT-PCR 实验证实，TTK 敲低促进 ULK₁ mRNA 外显子 5 跳跃，导致产生提前终止密码子的转录本，这些转录本通过 NMD 途径降解。沉默 NMD 核心因子 UPF₁后，外显子 5 跳跃转录本水平增加，说明 TTK 敲低通过促进外显子 5 跳跃，触发 NMD 介导的转录本降解，影响 ULK₁表达。

• TTK 介导的 SRSF₃ Ser¹⁰⁸磷酸化防止 ULK₁外显子 5 跳跃：IP-MS 结果提示 SRSF 家族可能参与 TTK 对 ULK₁前体 mRNA 剪接的调控。敲低 SRSF₃增强 ULK₁外显子 5 跳跃，RNA 免疫沉淀（RIP）证实 SRSF₃与 ULK₁前体 mRNA 相互作用。预测并验证 SRSF₃与 ULK₁外显子 5 的结合序列为 GCAACGG，突变该序列会减少外显子 5 的包含。此外，TTK 与 SRSF₃相互作用并磷酸化其 Ser¹⁰⁸位点，SRSF₃敲低或 Ser¹⁰⁸突变会增加 ULK₁外显子 5 跳跃，降低 ULK₁ mRNA 和蛋白水平，而野生型 SRSF₃能挽救这些变化，表明 TTK 通过磷酸化 SRSF₃的 Ser¹⁰⁸位点，防止 ULK₁外显子 5 跳跃，调节 ULK₁表达。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 TTK 在膀胱癌发展和进展中的关键作用。TTK 通过双重机制调节线粒体自噬，一方面磷酸化 ULK₁的 Ser⁴⁷⁷位点激活线粒体自噬，另一方面通过磷酸化 SRSF₃的 Ser¹⁰⁸位点调节 ULK₁前体 mRNA 剪接。破坏这些过程会导致线粒体功能障碍、mtROS 积累和细胞凋亡，凸显了 TTK 在维持膀胱癌线粒体稳态中的重要性 。从治疗角度看，靶向 TTK 可通过损害线粒体自噬和激活线粒体凋亡途径促进 BC 细胞凋亡。TTK 抑制剂 CFI-402257 在体内有效抑制肿瘤生长，为膀胱癌治疗提供了新的潜在策略。此外，线粒体自噬失调与化疗和靶向治疗耐药相关，抑制 TTK 可能使耐药 BC 细胞对这些疗法更敏感，有望提高传统治疗的疗效。该研究不仅为膀胱癌治疗提供了新方向，也为其他存在线粒体自噬异常和治疗耐药的癌症研究奠定了基础。