揭秘 MIXL1：调控人诱导多能干细胞向内胚层分化的关键钥匙

本文聚焦人诱导多能干细胞（hiPSCs）向内胚层分化研究。发现 MIXL1 早期激活与 hiPSCs 向内胚层分化效率相关，可影响染色质可及性及信号通路，为深入理解内胚层分化机制、筛选合适细胞系提供依据，助力干细胞治疗发展。

　　

引言

人诱导多能干细胞（hiPSCs）具备分化为多种细胞和组织类型的强大能力，在再生医学领域极具潜力。科研人员已开发出多种方案，旨在引导 hiPSCs 分化为理想的内胚层细胞或组织，如确定性内胚层（DE）、肠道细胞、胰腺细胞和肝细胞等。然而，不同 hiPSCs 系向内胚层分化的倾向存在显著差异，这一现象受遗传因素和体细胞或表观遗传记忆等多种因素影响，即便细胞系来自相同细胞资源且在相同条件下重编程，表观遗传记忆对功能性组织建立的影响仍未完全明确。

在本研究中，科研团队对四组源自不同细胞来源的 11 个 hiPSCs 系展开研究，追踪它们从多能细胞向 DE、肝细胞和肠道类器官（hIOs）的分化过程。研究发现，早期激活且高水平的 MIXL1 活性与 hiPSCs 向内胚层分化的增强倾向密切相关，这一发现为深入理解内胚层分化机制以及优化干细胞治疗策略提供了重要线索。

结果

1. hiPSCs 中 DE 分化效率的差异：研究人员选取了 11 个来自不同遗传背景细胞来源的 hiPSCs 系，按照 STEMDiff DE 方案诱导其向 DE 分化。在分化的第 0 天（多能性阶段）至第 4 天（DE 形成阶段），每天从三个重复培养物中收集细胞，并分析 88 个参与调控多能性向胚层分化基因的表达情况。主成分分析（PCA）结果显示，C32 系在 4 天的分化过程中进展最慢。通过计算主成分 1（PC1）得分对 hiPSCs 系的 DE 分化效率进行排序，发现 C32 和 C7 系的分化效率最低，而 C9 和 C11 系最高。此外，同一等基因组成员间的细胞系在分化效率上更为接近，表明细胞系的遗传背景对 DE 分化效率影响较大。进一步对 5 个细胞系（C32、C7、C9、C11 和 C16）进行研究，结果显示 C32 系在第 4 天的 DE 分化中，内胚层转录因子 FOXA2 和 SOX17 的表达水平最低，这表明 C32 系向 DE 分化的效率较低。
2. 低内胚层倾向系难以产生高级内胚层细胞类型：为评估 C32 和 C11 hiPSCs 系的内胚层分化倾向，研究人员进行了肝细胞分化实验。结果表明，这两个细胞系均能分化为肝细胞，但在分化过程中存在差异。在肝细胞分化阶段，微流体逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析显示，C32 和 C11 系的转录组无显著差异，但在 DE 分化阶段，C32 系的分化明显滞后于 C11 系。此外，C32 衍生的肝细胞中细胞色素 P450 3A4 活性较低，这表明 C32 肝细胞与 C11 肝细胞可能具有不同的生理特性。在 hIOs 生成实验中，C32 系在出芽球状体阶段生成的球状体数量少于 C11 系，且在嵌入基质胶后的生长受到抑制，无法进展到第 3 代以后；而 C11 系衍生的 hIOs 能够持续生长，并建立起典型的肠上皮细胞类型，具有较强的增殖和分化能力。这些结果表明，C32 系向内胚层及其高级衍生物分化的倾向较低，难以促进肠道形态发生。
3. 低倾向细胞系在向原始条纹样细胞分化过程中呈现独特的分子特征：利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，研究人员对低内胚层倾向的 C32 系以及高内胚层倾向的 C11 和 C16 系在分化的第 0 天、第 1 天和第 4 天进行分析。t 分布随机邻域嵌入（t-SNE）图显示，细胞按时间分为三个主要簇。C32 细胞在第 1 天和第 4 天呈现出独特的转录组特征，在第 1 天，55% 的 C32 细胞仍保留外胚层特征，未表现出原始条纹样细胞状态，且维持较高水平的多能性相关因子表达，而与原始条纹分化和内胚层相关的基因则下调。到第 4 天，C32 细胞具有中胚层特征。进一步对细胞状态标记基因的表达进行比较发现，C32 系在第 1 天多个原肠胚形成相关基因表达下调，在第 4 天内胚层相关基因表达水平也较低。此外，C32 系在第 1 天的 MIXL1 表达水平与基于第 4 天假时间得分的分化效率排名高度相关。这些结果表明，C32 细胞向原始条纹样细胞分化存在延迟且效率低下。
4. 低效率细胞系中的 Hippo 信号通路和细胞黏附：通过对低倾向（C7 和 C32）和高倾向（C9、C11 和 C16）细胞系在 DE 分化第 1 天进行批量 RNA 测序（RNA-seq）分析，发现 C32 系与其他细胞系存在显著差异。C32 系显示出中胚层（循环系统和心脏相关基因）和外胚层（神经相关基因）衍生物的转录组特征富集，而与原肠胚形成相关的基因则下调。与同组中 DE 分化效率较高的 C7 系相比，C32 系中与细胞黏附和 Hippo 信号通路相关的基因表达增强。这些结果表明，C32 系在胚层分化中倾向于外胚层和中胚层，内胚层分化倾向较低，同时也暗示了 Hippo 信号通路和细胞黏附可能在不同等基因背景细胞系的内胚层分化倾向差异中发挥作用。
5. 单细胞转录组分析作为评估谱系分化倾向的工具：为验证本研究中 hiPSCs 系的发现是否适用于其他 hiPSCs 系，研究人员将本研究的 scRNA-seq 数据集与 125 个已进行体外内胚层分化分析的 hiPSCs 系数据集相结合。尽管两个数据集采用了不同的文库制备和测序技术以及分化方案，但通过基于第 4 天 PC1 特征值对细胞系的内胚层分化倾向进行排名，发现 C32 系位于分化倾向最低的 20% 细胞系中，而 C16 和 C11 系排名较高。对分化第 1 天的高分化倾向（前 20）和低分化倾向（后 20）细胞系进行差异表达基因分析，发现前 20 细胞系中与原始条纹形成相关的基因上调，而后 20 细胞系则保留多能性特征。这表明后 20 细胞系进行原始条纹分化的能力较弱，C32 系的特征在其他低内胚层分化倾向的 hiPSCs 系中也存在。综上所述，无论采用何种测序技术和分化方案，scRNA-seq 数据均可通过 PC1 特征值得分对 hiPSCs 系的内胚层分化效率进行排名，有助于在使用这些细胞生成内胚层衍生物之前选择具有最佳分化倾向的细胞系。
6. MIXL1 对促进原始条纹分化至关重要：鉴于 MIXL1 在小鼠胚胎内胚层形成中的重要作用，研究人员推测其在人干细胞内胚层分化中也具有关键作用。为此，他们通过 CRISPR 编辑技术在 C32 和 C16 系中构建了 MIXL1 功能缺失细胞系（C32-MKO 和 C16-MKO），并在 C32 系中构建了可诱导 MIXL1 表达的细胞系（C32-iMIXL1）。通过免疫荧光实验量化 MIXL1 蛋白表达，发现 C32-MKO 和 C16-MKO 中无 MIXL1 表达，而 C32-iMIXL1 在诱导后可表达 MIXL1，且在 1μg/mL 多西环素诱导下，其 MIXL1 表达水平处于高倾向 C16 系第 1 天的生理范围内。利用 2D 干细胞微图案模型评估 MIXL1 功能，发现 C32 系在激活 MIXL1 方面存在延迟，而在 C32-MKO 和 C16-MKO 系中，MIXL1 表达缺失或处于背景水平，且 TBXT 表达在 C32 和 C32-MKO 系中均维持在基础水平，在 C16 系中呈现正常变化模式。这些结果表明，MIXL1 在原始条纹分化中发挥着重要作用。
7. MIXL1 在染色质组织中的作用：为探究 MIXL1 对染色质可及性的影响，研究人员对 C16 和 C16-MKO 细胞系在 DE 分化第 1 天（MIXL1 表达最高时）进行转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析。结果显示，MIXL1 缺失导致染色质可及性发生多种变化，关闭区域减少，开放区域增加。对差异可及染色质区域进行基序发现分析，发现 MKO 系中可及性降低的峰包含 MIXL1 识别的双同源框基序 TAATNNNATTA，而可及性增加的峰与 TEAD1 和 FOXH1 基序相关。FOXH1 是 GSC 的辅助因子，可负向调节小鼠中的 MIXL1；TEAD1 是 Hippo 信号通路抑制时 YAP/TAZ 结合的转录因子。这些结果表明，MIXL1 激活可能导致 TEAD1 可及区域关闭，且 MIXL1 可能通过调节染色质可及性影响 Hippo 和 WNT 等信号通路的活性。
8. 生理水平的 MIXL1 活性可增强低效率 iPSCs 的内胚层分化倾向：研究人员通过量化 MKO 和 iMIXL1 系分化 4 天后 FOXA2 和 SOX17 的表达，评估不同水平 MIXL1 表达对 DE 分化的影响。结果发现，C32-iMIXL1 中 MIXL1 表达增加可导致 FOXA2 和 SOX17 表达升高，而 C32-MKO 细胞的 FOXA2 和 SOX17 表达水平与 C16-MKO 和 C32-iMIXL1:Dox0 相似，这表明 MIXL1 失调可能不是内胚层分化低效的唯一原因，但调节 MIXL1 表达可影响 DE 形成。在微图案实验中，C32 系在 BMP4 诱导 48 小时后未检测到 FOXA2+/SOX17 + 双阳性细胞，而 C16 系中存在此类细胞。MKO 系中 MIXL1 活性缺失导致 FOXA2 + 细胞数量减少，SOX17 表达不变。在低倾向的 C32-iMIXL1 系中诱导生理水平的 MIXL1 活性，可增加 SOX17 + 和 FOXA2 + 细胞的数量和密度，且随着多西环素浓度增加，双阳性细胞数量进一步增加。这表明恢复 C32 系中生理水平的 MIXL1 活性可增强 iPSCs 的内胚层分化倾向，且 MIXL1 表达水平与 DE 分化效率之间存在因果关系。

讨论

本研究对 hiPSCs 系向内胚层分化的倾向进行了深入分析，发现 C32 系在向内胚层谱系分化方面效率较低，且存在向中胚层谱系分化的偏向，这与小鼠 Mixl1^?/?表型中中胚层增多、内胚层缺失的现象一致，同时也与 C32 系用于生成主要包含中胚层衍生物的肾脏类器官的研究结果相符。

通过转录组分析，研究人员试图寻找 hiPSCs 系在内胚层分化倾向的分子标记，但在多能性和早期退出阶段未发现明显的谱系分化偏向。综合对 4 组 hiPSCs 系的转录组分析，进一步证实了 C32 系内胚层分化效率低下，且与其他细胞系相比，其胚层分化起始存在延迟。

将本研究的单细胞转录组数据与大规模研究数据相结合，发现尽管实验方案和测序化学方法不同，但结果具有高度可比性。分化分数最低的细胞系中，参与原肠胚形成的基因（包括 MIXL1）表达显著较低，这不仅验证了微流体 RT-qPCR 的研究结果，还为通过内胚层分化倾向对 hiPSCs 系进行排名提供了新的工具。

研究还表明，MIXL1 在内胚层分化能力不足的细胞系中表达较低，是筛选等基因人多能干细胞系内胚层分化能力的有用分子标记。ATAC-seq 数据揭示了 MIXL1 在调节染色质可及性方面的新作用，其可能通过调节染色质状态影响 Hippo 和 Wnt 信号通路，进而影响内胚层分化。

此外，本研究首次证明了在人多能干细胞中，MIXL1 激活与 DE 分化之间存在因果关系，且 MIXL1 表达的时间和剂量控制对 DE 分化至关重要。本研究为深入理解内胚层分化机制提供了重要依据，为未来研究多能干细胞胚层分化和人类胚胎发育过程中的内胚层特化奠定了基础。

方法

1. 实验模型和研究对象详情：本研究使用了 11 个人 iPSC 系，这些细胞系由澳大利亚昆士兰大学澳大利亚生物工程和纳米技术研究所提供，分别来自 4 名患者（2 男 2 女），由成纤维细胞或包皮组织通过非整合型附加体质粒重编程系统（oriP/EBNA1 - 基于 pCEP4 附加体质粒 pE - P4EO2SCK2MEN2L 和 pEP4EO2SET2K）携带 OCT4、SOX2、KLF4 和 CMYC 基因重编程而来。所有细胞系均保持正常核型，能够形成包含三个胚层衍生物的畸胎瘤。在常规培养中，hiPSCs 在预包被有人胚胎干细胞（hESC）合格基质胶的六孔板中，使用 mTeSR1 培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养，每天更换培养基，当细胞汇合度达到 70% - 80% 时，使用 ReLeSR 试剂按照 1/5 至 1/30 的比例传代。本研究获得了悉尼儿童医院网络人类研究伦理委员会的批准（参考号 HREC/17/SCHN/167）。
2. 分化方案：使用 STEMdiff 确定性内胚层试剂盒，按照制造商的方案将细胞直接诱导分化为 DE。具体步骤为：首先用 StemPro Accutase 细胞解离试剂将细胞消化为单细胞，以 5×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 24 孔板中，培养基为含有 Y - 27632 二盐酸盐 Rock 抑制剂的 mTeSR1。24 小时后，用杜氏磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，然后在 STEMdiff 确定性内胚层基础培养基中培养 4 天，第 1 天添加补充剂 A 和 B，后续 3 天仅添加补充剂 B，每天更换培养基。每天收集样品用于 RNA 和蛋白质提取（n = 3）。
3. 微流体 RT - qPCR 的制备和分析：使用 ISOLATE II RNA mini 试剂盒按照说明书从速冻细胞沉淀中提取总 RNA，通过 DNase 1 消化去除潜在的基因组 DNA 污染，然后使用 Nanodrop ND - 1000 分光光度计测定 RNA 浓度。将总 RNA 调整至 200 ng/μL，取 5 μL 反应体系进行逆转录，反应条件为 25°C 5 分钟、42°C 30 分钟、85°C 5 分钟。取 3.75 μL 预扩增混合液（包含 Preamp MasterMix、100 μM 混合引物和 DNAse/RNAse - 无核酸酶水）和 1.25 μL cDNA 样品进行预扩增，反应条件为 95°C 2 分钟，然后进行 10 个循环的 95°C 15 秒、60°C 4 分钟。预扩增后进行 cDNA 纯化，向每个孔中加入 2 μL 包含 DNase - 无核酸酶水、10×Exo1 反应缓冲液和 Exonuclease I 的混合液，在 37°C 孵育 30 分钟，80°C 孵育 15 分钟，然后用低 EDTA TE 缓冲液稀释 10 倍。按照特定配方制备样品混合液和引物混合液，将其加载到 96.96 Dynamic Array IFC 板上，并在 Biomark HD 系统上运行。
4. CRISPR - KO 工程：使用 Geneious 软件设计靶向 MIXL1 外显子 1 的单链化脓性链球菌 Cas9 sgRNA（GCGCCGCGTTTCCAGCGTACCGG），基于靶位点存在的规范 NGG PAM 序列（下划线部分）进行设计，并使用该软件识别潜在的脱靶位点。将 sgRNA 克隆到 Addgene 质粒 62988 中，使用的寡核苷酸序列为：正向 5′ CACCGCGCCGCGTTTCCAGCGTAC，反向 5′ AAACGTACGCTGGAAACGCGGCGC。
5. C32 - iMIXL1 工程：通过慢病毒转基因在 C32 人 iPSC 系中过表达 MIXL1，该慢病毒携带多西环素诱导的 dSpCas9 - VP64。具体操作是将 C32