低氧与 GCM1 表达缺失对人滋养层干细胞分化及接触抑制的影响：胎盘发育机制新探

这篇研究聚焦人滋养层干细胞（hTSCs），发现低氧促进 hTSC 自我更新但抑制其向合体滋养层（STB）和绒毛外滋养层（EVT）分化。转录因子 GCM1 在低氧时下调，其缺失同样阻碍分化并影响接触抑制。该研究为理解胎盘发育机制提供重要依据。

　　

一、研究背景

在胚胎发育早期，胎盘在低氧环境（约 1% - 2% O₂）中发育。人滋养层干细胞（hTSCs）可分化为合体滋养层（STB）和绒毛外滋养层（EVT），这些细胞在胎盘的营养、气体交换及与母体组织的相互作用中发挥关键作用。然而，氧浓度如何调节胎盘细胞的自我更新和分化尚未完全明确。在小鼠模型中，缺氧对滋养层分化有特定影响，且与人类存在差异。在人类中，缺氧对 STB 分化的抑制作用已较明确，但对 EVT 分化的影响存在争议。随着 hTSCs 体外培养条件的发现，为研究氧浓度对人胎盘细胞的影响提供了契机。

二、研究结果

1. 低氧维持滋养层干细胞干性
   • 研究人员将 hTSCs 在不同氧浓度（20%、5% 和 2% O₂）下培养，发现低氧条件下，hTSCs 的 EVT 标记物 ITGA1 表达减少，HLA - G 表达略有增加，STB 标记物 hCGB 表达降低，细胞密度更高。这表明低氧有助于 hTSCs 维持干性和增殖，而高氧促进其自发分化。
   • 进一步进行定向分化实验，结果显示，若在 20% O₂条件下进行分化，不同初始氧浓度培养的 hTSCs 都能成功分化为 EVT 或 STB；但在低氧条件下进行分化时，hTSCs 向 EVT 和 STB 的分化受到显著抑制。例如，低氧分化的 EVTs 无法下调 EpCAM 或上调 ITGA1 和 HLA - G，STBs 则保留更多干细胞标记物 TEAD4，表达更少的 STB 标记物 hCGB。
   
   
2. 滋养层分化转录因子 GCM1 对氧敏感
   • 通过对不同氧浓度下培养的 hTSCs 进行 RNA 测序（RNA - seq），发现基因表达强烈依赖于氧张力。基因聚类和富集分析表明，低氧（2% O₂）上调的基因与缺氧反应和 WNT 激活相关，而高氧（20% O₂）上调的基因与胎盘相关。与 EVT 和 STB 表达相关的基因在 2% O₂条件下表达较低，hTSC 基因在 2% O₂条件下表达较高。
   • 分析已知转录因子（TF）靶点发现，HIF1α 与低氧表达相关，GCM1（glial cells missing TF 1）与高氧浓度相关。GCM1 在 hTSCs 中表达，分化时上调，但在低氧条件下，其 RNA 和蛋白质水平均显著下调。使用 CRISPR 干扰抑制 VHL（von Hippel - Lindau tumor supressor），导致 HIF1α 靶基因 IGFBP3 上调，同时 GCM1 表达下调，证实 GCM1 受经典缺氧反应负调控。
   
   
3. GCM1 对滋养层细胞谱系分化至关重要
   • 研究人员构建了 GCM1 基因敲除的 hTSC（GCM1 KO1 和 GCM1^?/? KO2），结果显示，GCM1 缺失的 hTSCs 无法分化为 EVT 或 STB，其 EVT 和 STB 特异性基因表达降低，且在定向分化时无法上调这些基因。
   • 比较 GCM1 缺失和低氧对 hTSCs 的影响发现，GCM1^?/?细胞在 20% O₂下的基因表达与在 2% O₂下的对照 hTSCs 相似，表明低氧相关的差异基因表达部分是由于 GCM1 水平降低所致。
   • GCM1^?/? hTSCs 在培养过程中出现特殊形态，如形成三维穹顶状结构和空心球。在定向分化为 EVT 时，它们无法呈现 EVT 形态，而是上调细胞柱标记物 ITGB6，提示其分化受阻于细胞柱阶段。
   • 研究还发现，用磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）抑制剂 LY294002 处理 hTSCs，可模拟 GCM1 缺失的部分表型，如形成类似的穹顶状结构，抑制 TB - ORG 中 STB 和 EVT 的分化，表明化学调节 GCM1 水平会阻碍滋养层细胞分化。
   
   
4. GCM1 正向调节 EVT 和 STB 特异性调节因子
   • 对第 3 天的 EVTs 进行染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq），发现 GCM1 有 2271 个富集峰，其结合位点的基序分析显示对 GCM 结合基序有极强的富集。已知的 GCM1 靶基因如 PGF 和 LMO2 在这些峰附近得到证实。
   • 通过转座酶可及染色质测序（ATAC - seq）分析发现，GCM1 峰对应于 EVT 和 STB 中比 TSC 更开放的染色质区域。与 GCM1 敲除相关的差异表达基因分析表明，GCM1^?/?细胞中下调的基因与 GCM1 ChIP - seq 峰接近，包括一些已知的胎盘分化因子。此外，ATAC - seq 分析还显示，EVT 和 STB 特异性开放染色质区域中存在 GCM 基序，且与 GCM1^?/?细胞中相应细胞类型下调的基因相关。
   
   
5. GCM1 调节 CDKN1C 和滋养层细胞过度生长
   • 在基因组中，GCM1 的一个强富集位点位于 11p15.5 印记位点，该位点包含 KCNQ1、KCNQ1OT1 和 CDKN1C（p57^KIP2）等转录本。CDKN1C 可结合细胞周期蛋白 / CDK 并阻止细胞分裂。Hi - C 数据显示，GCM1 结合位点与 CDKN1C 启动子有高度相互作用。
   • hTSCs 在高汇合度时，GCM1 和 CDKN1C 会同时上调，且在低氧条件下，CDKN1C 表达降低，与 GCM1 水平变化一致。在 GCM1^?/? hTSCs 和分化细胞中，CDKN1C 显著下调。对照细胞在汇合时停止分裂，而 GCM1^?/? hTSCs 继续生长，类似 CDKN1C^?/?的表型，表明 GCM1 在汇合反应中位于 CDKN1C 上游，调控其表达。
   
   

三、讨论

1. 人鼠差异与 GCM1 的作用
   在小鼠中，缺氧有利于海绵状滋养层分化，而在人类中，低氧对 EVT 分化有抑制作用。这一差异可能源于 GCM1 在人鼠胎盘发育中的不同作用。GCM1 对人类 EVT 和 STB 的形成至关重要，而在小鼠中仅对 STB 形成有作用。因此，缺氧对 GCM1 的负调控在人类中会抑制 EVT 分化，而在小鼠中不会影响海绵状滋养层或滋养层巨细胞的形成。此外，虽然缺氧总体上抑制 EVT 分化，但却对 HLA - G 表达有促进作用，这可能与 hTSCs 的特性有关，hTSCs 表达一些与细胞柱 CTB 一致的标记，提示其更接近 EVT 样细胞。
2. 研究结果对病理的启示
   子痫前期的特征包括母体小动脉重塑不足、胎盘血供和氧供减少，以及 HIF - 1α 和 / 或 HIF - 2α 蛋白水平升高。本研究预测缺氧会导致未分化 CTB 增多，这与子痫前期中观察到的现象一致，表明该研究结果可能为子痫前期的发病机制提供新的见解。
3. 对滋养层细胞培养的意义
   在人胎盘来源的 TSC 类器官中，STB 分化通常发生在类器官内部，与绒毛的双层结构相反。通过降低 GCM1 水平，如使用 PI3K 抑制剂 LY294002 处理，可减少类器官的自发分化。然而，LY294002 抑制自发分化的机制在 TSCM 培养基中存在疑问，因为该培养基中 GSK3β 被 CHIR99021 持续抑制，而 LY294002 据报道是通过激活 GSK3β 来降低 GCM1 表达的。未来研究有望揭示这一机制，从而改进滋养层细胞的培养条件。
4. Wnt 信号通路与 GCM1 的关系
   Wnt 信号通路在维持 CTBs 和 hTSCs 中起重要作用，而 GCM1 可抑制 Wnt 信号通路。核 β - catenin 是经典 Wnt 通路的输出，在绒毛 CTBs 中存在，分化时消失。CHIR99021 是 Wnt 激活剂，对 hTSC 维持至关重要，去除它可促进分化。敲低 GCM1 会导致 Wnt 通路信号升高，阻碍 EVT 分化。本研究结果与这些发现一致，且观察到低氧条件下 Wnt 通路本体术语上调。GCM1^?/? TB - ORG 在诱导 EVT 分化时表达细胞柱标记物 ITGB6，表明这可能是 GCM1 缺陷的 hTSCs 所能达到的最分化状态。
5. GCM1 与肿瘤的关系
   在 hTSCs 的 CRISPR 敲除筛选中，GCM1 是生长限制基因，其缺失促进细胞生长，这可能是由于抑制了 hTSCs 的自发分化和降低了 CDKN1C 表达，从而减少了接触抑制。然而，在妊娠滋养细胞肿瘤（如妊娠性绒毛膜癌）中，GCM1 并非已知的肿瘤抑制因子。在葡萄胎来源的绒毛膜癌中，CDKN1C 表达已缺失，且非葡萄胎妊娠来源的绒毛膜癌中也无 GCM1 突变的证据。这可能是因为 GCM1 缺失虽导致细胞生长失控，但也阻止了上皮 - 间质转化（EMT）和侵袭性。不过，目前对妊娠滋养细胞肿瘤和相关胎盘肿瘤的突变分析仍有限，GCM1 在胎盘发育和胎盘癌中的新作用可能还有待发现。