基于CRISPR平铺筛选技术解析MEK1功能区域及其在耐药机制中的关键作用

本研究通过CRISPR平铺筛选技术系统鉴定了MEK1蛋白的功能性区域，揭示了其与癌细胞存活及MEK抑制剂耐药性的关联。研究人员结合结构分析与功能验证，发现MEK1-BRAF蛋白互作界面的关键区域（如R234_G237）对细胞存活至关重要，并鉴定出两个新型耐药相关区域（如C端F371/A372）。该研究为结构导向药物设计提供了功能位点图谱，同时阐明了耐药突变的新机制，为克服靶向治疗耐药性提供了理论依据。成果发表于《Communications Biology》。

　　

研究背景与意义
MAPK信号通路是肿瘤治疗的经典靶点，其中MEK1作为关键激酶，其功能区域与耐药机制尚未完全阐明。尽管已有多种MEK抑制剂（如trametinib、selumetinib）应用于临床，但肿瘤细胞通过突变逃逸药物抑制的现象频发。传统方法难以系统解析蛋白功能区域与耐药性的关系，而CRISPR平铺筛选（CRISPR tiling）技术的出现为这一难题提供了新思路。该技术通过高密度sgRNA覆盖靶基因编码区，可同时评估不同区域对细胞存活和药物响应的贡献。

Astex Pharmaceuticals的研究团队以MEK1为模型，首次采用配对细胞系（Cas9阳性与亲本细胞并行筛选）优化筛选策略，结合结构生物学与功能验证，绘制了MEK1的功能区域图谱，并揭示了耐药突变的新机制。

关键技术方法
研究采用CRISPR平铺筛选文库（300个sgRNA覆盖MEK1编码区），在BRAF^V600E突变黑色素瘤细胞系A375中开展：1）脱落筛选（drop-out screen）鉴定细胞存活必需区域；2）富集筛选（enrichment screen）在四种MEK抑制剂（selumetinib、trametinib、cobimetinib、binimetinib）压力下识别耐药相关区域。通过单基因座编辑验证突变功能，结合免疫共沉淀（co-IP）和分子动力学模拟（MD）解析机制。

研究结果

脱落筛选揭示MEK1功能核心区域
通过PAR/Cas9-D14 LFC（对数倍变化）分析发现，64.7%的MEK1靶向sgRNA显著耗竭，证实MEK1对A375细胞存活至关重要。关键区域包括：

• 激酶活性位点：P环（S72_L74）、铰链区（M146/D147）和催化环（P193/S194），与ATP结合和磷酸转移直接相关。
• 蛋白互作界面：Helix EF（R234_G237）和Helix G（V318/N319）是MEK1与上游激活因子BRAF结合的关键位点。结构模拟显示，R234_L235缺失变异体通过破坏疏水簇（含L235、L314等）完全阻断MEK1-BRAF结合。

富集筛选发现新型耐药区域
在MEK抑制剂压力下，以下区域sgRNA显著富集：

• N端调控域：Helix A（K57_K59）的缺失突变（如K59del）通过解除自抑制导致MAPK通路过度激活，对selumetinib耐药性提升57.8倍。
• C端无序区域：F371/A372缺失（A372del）虽未直接参与药物结合，但MD模拟显示其通过改变Helix A构象增强激酶活性。
• 变构口袋旁侧：Helix C（Q110/I111）和β7-β8环（R201/G202）的突变（如I111del）可能通过空间位阻干扰抑制剂结合。

耐药机制的双重路径
信号通路分析表明耐药突变分为两类：

1. 通路激活型：K59del、A372del等导致基础pERK水平升高，对MEK和BRAF抑制剂（如vemurafenib）交叉耐药。
2. 结合干扰型：I141_C142delinsEI通过变构口袋的静电排斥（AlphaFold模型显示Glu141与binimetinib的电子云排斥）特异性抵抗MEK抑制剂。

结论与展望
该研究通过CRISPR平铺筛选构建了MEK1功能-结构全景图谱，其价值体现在：

1. 指导药物设计：鉴定出未被开发的潜在靶向区域（如β7-β8环），为片段筛选（FBDD）提供功能验证依据；
2. 破解耐药难题：揭示C端无序区域的变构调控作用，拓展了对MEK1激活机制的认知；
3. 技术优化：配对细胞筛选策略提高信噪比，为其他靶点研究提供范式。

局限性包括NGG PAM序列覆盖度不足（仅47.5%残基），未来可采用PAM柔性Cas9变体提升分辨率。该成果为靶向MEK1的下一代药物开发奠定了理论和实践基础。