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本文聚焦鼠伤寒沙门氏菌（STM）感染机制。研究发现，内质网（ER）可促进含沙门氏菌液泡（SCV）分裂，维持一泡一菌状态。沙门氏菌效应蛋白 SteA 在此过程中起关键作用，缺失 SteA 会影响细菌增殖与致病性。这些成果为抑制沙门氏菌致病性提供新思路。
引言
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium，STM）是一种胞内病原体，可感染多种宿主并引发多种疾病，如胃肠炎和全身感染。它经粪口途径进入人体，利用多种策略克服胃酸、肠道菌群和胆汁盐等压力，最终到达小肠上皮细胞。进入宿主细胞后，沙门氏菌驻留在含沙门氏菌液泡（Salmonella - containing vacuole，SCV）中，成熟的 SCV 与溶酶体 / 晚期内体有一些共同特征，但其膜成分尚不完全清楚。此前研究表明，沙门氏菌在宿主体内以一菌一腔的状态存在，即 SCV 膜与沙门氏菌同步分裂，但分裂机制不明。细胞内细胞器间的接触位点对细胞器的分裂很重要，SCV 膜含有一些内质网（endoplasmic reticulum，ER）蛋白，且已观察到 SCV 与 ER 之间的膜接触位点，因此推测类似线粒体分裂的过程可能导致 SCV 分裂。
材料和方法
- 细菌菌株和培养条件：使用野生型 STM 菌株 ATCC 14,028 s 进行实验，在 LB 培养基中 37°C 振荡培养，根据需要添加抗生素。通过一步基因失活方法构建敲除菌株，并将野生型和突变菌株转化用于免疫荧光测定。
- 构建互补菌株和 SteA - eGFP 质粒：利用低拷贝数质粒 pQE - 60 制备 SteA - HA 互补菌株，通过 PCR 扩增、酶切、连接和电穿孔等步骤完成。使用 eGFP - N3 空载体构建 SteA - eGFP 质粒。
- 真核细胞培养、转染和质粒：培养 HeLa 细胞和 RAW 264.7 murine 巨噬细胞，在感染前进行质粒过表达或 shRNA 敲低实验，使用 Lipofectamine 3000 转染。多种质粒由不同教授馈赠，shRNA 质粒购自相关文库。
- 感染实验（庆大霉素保护试验）：将细胞接种并感染沙门氏菌，根据实验目的设置不同的感染复数（MOI），通过离心促进细菌黏附，用庆大霉素处理以杀死胞外细菌，在不同时间点收获细胞用于后续实验。
- 共聚焦显微镜：感染后固定细胞，进行免疫染色，使用共聚焦显微镜成像，通过特定软件进行图像分析和定量。
- 感染后细菌计数用于细胞内存活测定：感染后裂解细胞，将细胞裂解物涂布在 SS 琼脂上获得菌落形成单位（CFU），用于计算侵袭百分比和增殖倍数。
- RNA 分离和实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）：使用 TRIzol 提取 RNA，进行 DNase I 处理后制备 cDNA，用 qRT 引物和 SYBR green mix 在实时荧光定量 PCR 仪上评估基因表达，以 β - actin 作为内参。
- 体内动物实验：用 STM WT、STMΔsteA 和 STMΔsteA:steA 感染 6 - 8 周龄 C57BL/6 雌性小鼠，通过口服灌胃或腹腔注射给药，在不同时间点收获器官和血液，测定细菌定植情况和小鼠存活率。
- 统计分析：使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，根据数据类型选择合适的统计方法。
结果
- 沙门氏菌感染导致 UPR 激活和内质网扩张：许多细菌和病毒感染会激活 UPR 以维持生存，UPR 可缓解 ER 应激，维持 ER 稳态。研究发现，沙门氏菌感染后，ATF4 和 ATF6 从细胞质转移到细胞核，表明野生型沙门氏菌可激活 UPR，且通过 PERK 和 ATF6 途径。转录分析显示，感染后期 ER 塑形蛋白 Reticulon - 4a（RTN4A）和 CLIMP63 转录水平上调，感染细胞中 ER 管状结构百分比增加，表明沙门氏菌感染导致 ER 形态改变。
- ER 管状结构的扩张促进 SCV 增殖和分裂：动态的 ER 管状结构在形成膜接触位点中起重要作用。过表达 Rtn4a 增加 ER 管状结构，促进沙门氏菌增殖，敲低 RTN4A 则抑制增殖；过表达 CLIMP63 增加 ER 片层结构，减少 SCV 数量和细菌增殖。活细胞成像显示，ER 管状结构在 78% 的 SCV 分裂事件中标记分裂位点，表明 ER 管状结构有助于 SCV 增殖和分裂。
- 沙门氏菌转运效应蛋白 SteA 对维持 SCV 与 ER 的关联至关重要，确保一菌一腔状态：SCV 分裂导致一菌一腔，steA 突变株（STMΔsteA）以多菌一腔的形式存在，表明 SteA 对 SCV 正确分裂很重要。显微镜图像显示，SteA 富集的 SCV 与 ER 接触，ER 与 STM WT 和 STMΔsteA:steA 的 SCV 共定位比与 STMΔsteA 的 SCV 更多，表明 SteA 有助于 SCV 与 ER 接触。
- STMΔsteA 在体内增殖和致病性存在缺陷：STMΔsteA 在 HeLa 细胞系中增殖显著低于 STM WT 和 STMΔsteA:steA，其形成的 SCV 直径更大，且与自噬标记物 LC3B 共定位更频繁，可能被细胞自噬机制清除。STMΔsteA 感染的细胞中 Lysosome 相关膜蛋白 1（LAMP1）强度较高，表明其无法改变溶酶体动力学。体内实验显示，腹腔注射 STMΔsteA 后，其在脾脏和肝脏中的定植减少；口服灌胃感染后，虽然在某些器官中的定植无显著差异，但小鼠死亡时间延迟，表明 SteA 对体内致病性很重要。
讨论
细菌病原体采用多种策略在宿主细胞中生存，沙门氏菌感染诱导 ER 应激并激活 UPR，UPR 激活导致 ER 扩张和磷脂生成增加，有利于细菌生长。ER 管状结构对沙门氏菌增殖至关重要，SteA 在维持 SCV 与 ER 的接触中起关键作用，缺失 SteA 会导致细菌增殖缺陷和体内致病性改变。不同感染途径对 STMΔsteA 的定植和致病性影响不同，口服灌胃和腹腔注射存在差异，需进一步研究。本研究揭示了细菌利用 ER 动态重塑的策略，为抑制细菌增殖提供了潜在的靶向方法。
